Onlinesystem:http://www.jabiotech.org农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2013.21(9):1125-1134DOI:10.3969/j.issn.1674・7968.2013O9.015技术改进UpdatedTechnology同步检测海水养殖动物5种病原菌的扩增子拯救多重PCR(Arm・PCR)方法的建立与应用耿伟光"史成银'李晋।黄健।王秀华।谢国驷।I农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071；2上海海洋大学水产与生命学院，上海201306•通讯作者,shicy@ysfri.ac.cn摘要鳗弧菌。/加0ang向防r〃m)、哈维氏弧菌(V.痴的。、嗜水气单胞菌(/leromonas/tydrop/uYa)、迟缓爱德华氏菌(Edaardsiella痴血)和副溶血弧菌(Lparahaemolyticus)^,我国海水养殖动物5种重要的病原菌。本研究在分析了其致病因子基因的基础上，依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理，设计了5套特异性的套式PCR引物，并在各内引物的5,端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列;通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2,浓度、dNTPs浓度以及7agDNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化，最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为：lOxPCRBuffer520mmol/L的Mg2),dNTP洛2.5mmol/L)5此,7丝酶(2.5U/pL)0.6nL>1OxPrimerMix(2nmol/L)5匹,DNA模板各1pL,灭菌双蒸储水补足至50RL,反应的退火温度为55工。实验结果表明：对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌，使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测，得到大小分别为144、190、266、315和371bp的特异性产物，其检出灵敏度分别为1.745J.847,16.000,28.126和369.900pg细菌基因组DNA;该方法特异性强，与大肠杆菌(Esc/ie成人沁co办溶藻弧菌化期•/"证心)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteronwnas，如)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)等其他细菌以及半滑舌/基因组DNA不产生交叉反应。2012年,应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测，确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌，证实该方法具有良好的可靠性和实用性。该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查，也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础。关键词鳗弧菌，哈维氏弧菌，嗜水气单胞菌，迟缓爱德华氏菌，副溶血弧菌，套式PCR,检测EstablishmentandApplicationofAmpliconRescueMultiplexPCR(Arm-PCR)fbrtheSimultaneousDetectionofFiveMajorBacterialPathogensfromMarineAquacultureAnimalsGENGWei-Guang12SHICheng-Yin'*LIJin'HUANGJie1WANGXiu-Hua'XIEGuo-WIKeyLaboratoryotSustainableDevelopmentofManneFisheries,MinistryofAgnculture;YellowSeabishenesResearchInstitute,Chinese基金项目：中国水产科学研究院黄海水产研究所“中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金”(No.20603022012009)和国家科技支撑计划(No.2012BAD17B01)收稿日期：2013-03-21接受日期：2013-05-031126农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnologyAcademyofFisherySciences,Qingdao266071,China;2CollegeofFisheriesandLifeScience.ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China•Conrcspondingauthor,shicy@ysfri.ac.cnAbstractVibrioanguillanim,V.harveyi,AeromonashydrophilaEdwardsicllatardaandV.parahaemolyticusarefivemajorbacterialpathogensisolatedfrommarineaquacultureanimalsinChina.Inthisreport,fivesetofnestedspecificprimersweredesignedbasedonthepathogenicfactorgenesandaspecificampliconrescuemultiplexPCR(Arm-PCR)forthesimultaneousdetectionofthesefivemajorbacterialpathogenswereestablished.TheconcentrationofprimerMix,Mg2*,dNTPs,TaqDNApolymeraseandtheannealingtemperatureinthefirststepofArm-PCRwereoptimizedinthisstudy.Withsummarizingtheresultsoftheexperiment,in50pLofreactionvolum...