Hospital,theThirdMilitaryMedical人表皮干细胞体外分离培养及鉴定［摘要］目的：探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法：中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层，并获得表皮单细胞悬液，采用IV型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况，检测细胞克隆形成率，免疫组化染色观察表皮干细胞标志物B1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果：组织学观察显示，培养24h后细胞呈克隆状生长；所分离、培养细胞的克隆形成率髙于对照角质形成细胞组；免疫组化染色显示，培养细胞B1整合素及K19均呈阳性表达。结论：运用IV型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。［关键词］表皮干细胞；细胞培养；细胞分离；鉴定［中图分类号1Q813.1［文献标识码］A［文章编号11008-6455(2007)10-1343-03Isolation,cultureandidentificationofhmnanepithelialstemcellsLIDan,LIShi~rong,CAOChuan(DepartmentofCosmeticSurgery,Southwest---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---University,Chongqing400038,China)Abstract：ObjectiveToexploreamethodforisolationandcultureofhumanepidermalstemcells・MethodsTheEpidermalstemcellwereisolatedbyadheringtocollagentypeIVafterobtainedbydigestinghumanforeskinwithDispaseIIandTrypandcultureinvitroinK~SFM.TheexpressionsofB1-integrinandkeratin19(K19)inepidermalstemcellweredetectedwithimmunocytochemicalmethods,andthecolonyformingefficiencywasalsostudied・Keratinocyteswereservedalsodetected.ResuItsItwasrevealedbyhistologicalobserva.tionthatcolonieswereformed24hoursafterinoculation.Theisolatedandculturedcellcloningefficiencywashigherthanthatofthecontrolgroup・PositiveexpressionofB1-integrinandK19ofculturedcellswasdetectedbyimmunocytochemistry.ConclusionAduItepidermalstemcellscouldbesuccessfullyisolatedandculturedbyadhensionwithtypeIVcollagenandculturewithK-SFMKeywords：epidermalstemcells；cellculture；cellisolation；identification---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---皮肤作为人体最大的器官，外层的表皮终身不断自我更新这种更新由表皮基底层具有再生能力的角质形成细胞分裂、增殖、分化来完成。皮肤角质形成细胞主要包括表皮干细胞（epidermalstemcell,ESC）、短暂扩增细胞（transitAmplifyingcell,TAcell）及终末分化细胞（postmitoticdifferentiatingcell,PMDcell）[2]o其中，位于基底部的表皮干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞。从而在维持组织结构的更新、细胞内环境的稳定和创伤后创面修复过程中起着至关重要的作用，但由于ESC数量较少（只占基底细胞总数的1%〜10%[1]）,缺乏明确的特异性分子标志,体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性，因而如何大量获得纯度较高的表皮干细胞即成为目前干细胞研究领域的热点。本研究利用酶消化法和IV胶原筛选贴壁对人包皮表皮干细胞进行分离和纯化，以期为进一步研究奠定基础。1材料和方法1.1角质细胞无血清培养基（SFM-KC）（美国Gibco公司）,Dispease酶（美国Gibco公司）,人胎盘IV型胶原（美国Sigma公司），胰蛋白酶、小鼠抗人角蛋白19、小鼠抗人B1整合素，PowerVisionTM二步法免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）O1.2标本采集与处理：包皮皮片来自本院泌尿外科包皮环切术患者，无泌尿系统疾病感染。患者年龄5〜25岁，所取皮---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---片均得到患者知情同意。1.3试剂制备：①K-SFM的配制：500mlK-SFM加入lml培养基添加剂，分装后4£保存备用；②中性蛋白水解酶的配制：中性蛋白水解酶25mg,用D-Hanks溶解定容至100ml,过滤除菌，49保存备用；③IV型胶原包被培养瓶及细胞爬片的制备：IV型胶原溶于体积分数...