三生饮对局灶性脑缺血大鼠海马区Bcl2和Bax蛋白表达的影响作者：王长松,王媛媛,晋光荣目的：探讨三生饮对大鼠局灶性脑缺血后海马区细胞凋亡相关基因Bcl2和Bax蛋白表达的影响。方法：用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用SP免疫组织化学方法，检测再灌注后3、6、12、24h及3d不同时段海马区Bcl2和Bax免疫反应阳性细胞平均计数，统计分析三生饮治疗组和模型组的表达量。结果：两组海马区神经元均大量表达Bax蛋白，两组间无统计学差异；与模型组相比，三生饮治疗组大鼠缺血侧海马区Bcl2蛋白表达增多，表达时程延长（P《0.05）；在缺血侧海马不同区域，Bcl2/Bax之值不同。结论：大鼠脑缺血再灌注后海马区神经元均有Bcl2和Bax蛋白的表达，而灌给三生饮可促进海马区Bcl2阳性细胞的表达，提高Bcl2/Bax值；但三生饮治疗组大鼠海马区脑细胞仍然过度表达Bax阳性蛋白，最终发生凋亡。三生饮；脑缺血；海马；Bcl2蛋白；Bax蛋白；大鼠三生饮是治疗卒中的代表方剂。以往的研究表明，该方可以缩小脑缺血大鼠的梗死体积，在局灶性脑缺血再灌注损伤中，可增加缺血---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---侧大脑皮质Bcl2的表达，延长表达时程，提高Bcl2/Bax之值，减少脑缺血后的细胞凋亡[1]。本实验拟进一步观察该方对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马区Bcl2和Bax蛋白表达的影响，以期为揭示三生饮的作用机理提供实验依据。1材料与方法1．1动物健康成年SD（SpragueDawley）大鼠99只，雌雄不拘，体重200~250g。1．2试剂兔抗Bcl2、Bax单克隆抗体（美国Santacrus公司），通用浓缩型SP（过氧化酶标记的链霉亲合素简称SP）试剂盒（山羊血清封闭液，生物素标记羊抗兔IgG，辣根酶标记链霉卵白素）、DAB显色液。以上抗体与试剂均从北京中山生物技术有限公司购得。1．3药物三生饮生药包括生南星30g、生川乌15g、生附子15g、木香7.5g、生姜18g，均由东南大学附属中大医院中药房提供，常规水煎，浓缩至实验所需浓度。1．4模型制作参照ZeaLonga线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型[2]。大鼠称重后，用0.4%戊巴比妥钠腹腔麻醉，固定于手术台上；分离右侧颈总动脉及同侧迷走神经，避免误扎；分离颈内及颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，用微动脉夹夹闭颈内---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---动脉，于颈总动脉远心端剪一小口插入尼龙线；松开微动脉夹，沿颈总动脉轻推线入颈内动脉至有阻力时止，系紧结扎线，缝合切口，线尾端露于体外；从颈总动脉分叉处算起进线约（18.5±0.5）mm，记录结扎时间，1.5h后拔出尼龙线10mm行再灌注；假手术组插入深度小于9mm。1．5分组及给药造模后参照Longa5分制评分标准评定，剔除0分及4分大鼠。将造模成功的大鼠随机分为模型组和三生饮治疗组（简称治疗组）各30只；分别在缺血再灌注后3、6、12、24h及3d5个时间点处死大鼠，每个时间点6只。另设正常对照组（简称正常组）3只，假手术组6只。给药：术前1d开始灌胃给药，每12h1次。其中，治疗组灌给浓度为1g#12539;ml-1的三生饮煎剂，每次2ml，其它各组灌给蒸馏水每次2ml。1．6取材与切片用0.4%戊巴比妥钠过量麻醉大鼠，开胸腔经心灌注固定后取脑，后固定2h，置30%蔗糖磷酸缓冲液中4℃过夜沉底；自视交叉后2mm处，切取厚为2mm的脑组织块，置Leica冰冻切片机切片，片厚7~8μm，隔5张取1张贴片，-20℃冰箱保存。1．7Bcl2、Bax免疫组化检测取出冰冻切片，室温融化，磷酸盐缓冲溶液(PBS）冲洗5min×3次，分别滴加0.3%双氧水(H2O2）10min、羊血清封闭液（1∶10）15min，一抗---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---（1∶100），4℃冰箱过夜。生物素标记羊抗兔IgG（1∶300），37℃恒温箱30min，辣根酶标记链霉卵白素（1∶300），37℃恒温箱30min。以上各步骤均以0.01mol#12539;L-1PBS（pH7.2~7.4）冲洗3min×3次，DAB显色，镜下控制反应时间，终止反应；苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察。对照试验用PBS代替一抗，余同上，结果阴性。1．8统计学处理每张切片随机采集6个具有代表性的高...