一个猪场高致病性PRRSV的分离鉴定摘要：本研究对一个猪场高致病性PRRSV疑似病例进行了病理剖检、PRRSVN蛋白基因RT-PCR扩增以及序列测定和分析。结果表明，N2号分离株N蛋白核昔酸序列与高致病性毒株(JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株)的一致性均为99.1%,N3/N4号与高致病性毒株的一致性均为98.9%,由此判定该猪场病猪感染毒株为高致病性PRRSVo该研究结果可为养猪生产中高致病性PRRSV感染的判断提供借鉴。关键词：病理解剖；PRRS；高致病性PRRSV；RT-PCR；序列测定中图分类号：S858.285.3文献标识号：A文章编号：1001-4942(2016)12-0129-04AbstractThesuspectedcasesofhighlypathogenicPRRSVfromapigfarmwereconductedautopsy,thegenesequeneeofN-proteinofPRRSVwasamplifiedbyRT-PCR,andthenitssequeneewasdeterminedandanalyzed・TheidentityofthenucleotidesequeneeofN-proteinwas99.1%betweentheisolateN2andthehighlypathogenicstrains(JXA1,HuN4,SX-1andTJM),andthatofisolateN3/N4was98.9%withthehighlypathogenicstrains.TheresultsshowedthattheinfectedviruswashighlypathogenicPRRSVinthepigfarm.ThisresearchprovidedarefereneeforthediagnosisofhighlypathogenicPRRSVinfectioninswineproduction.KeywordsPathologicalanatomy；PRRS；HighlypathogenicPRRSV；RT-PCR；Sequencing猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)俗称猪蓝耳病,由动脉炎病毒科猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起，是一种急性病毒性传染病[1,2]o高致病性PRRSV是我国现阶段猪蓝耳病流行的主导毒株,对猪呼吸系统、繁殖系统、神经系统、免疫系统、消化系统均有强的致病力，有很多猪场因为感染该病遭到毁灭性打击[3-8]o2016年6月份，某自繁自养的猪场发生疫情，该猪场的哺乳仔猪陆续发病，出现眼睑水肿、发热、食欲减退、皮肤发红、呼吸急促等现象,有的可见咳嗽、腹泻、震颤等症状，发病率达到80%,死亡率达到50%以上，使用黄罠多糖、抗生素等治疗效果均不明显。为了对该猪场病情进行确诊，以便对症治疗，本研究对疑似病例进行病理解剖、RT-PCR扩增及序列测定和分析，以期对PRRSV毒株做出准确判断，为及时米取有效的控制措施、提高猪的成活率提供依据。1材料与方法1.1样品米集对4例病死猪进行解剖，观察病理变化。分别采集各病猪的肾、脾、肺、淋巴结组织各少许，-20°C低温保存备用。1.2材料和试剂PRRSV阳性对照由本实验室保存；RT-PCR一步法试剂盒、DL2000DNAMarker、凝胶回收试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；PTC-2000型PCR仪购自美国MJResearch公司。1.3引物设计与合成根据PRRSVN蛋白基因序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为正向弓I物F：5’-ATGCCAAATAACAACGG-3z；反向弓I物R：5”-TGCTGAGGGTGATGCTGT-37。弓I物的扩增片段大小为369bp01.4样品处理与RNA提取样品RNA的提取参照文献[9],试验操作均在冰盒上完成，所用枪头、离心管均为RNase-freeo取约2g病料加入适量灭菌的PBS溶液(0.01mol/L,pH7.4)进行研磨，研磨后反复冻融3次，4°C、5000r/min离心2min；取250»L上清加入750uLTrizol和200uL氯仿,振荡混匀,-20°C静置5min,4°C、12000r/min离心15min；取500uL±清加入等量的异丙醇，颠倒数次，-20°C静置20min,4°C、12000r/min离心15min收集沉淀；75%酒精洗涤沉淀后，20HL灭菌水溶解沉淀即为样品RNA,-80°C保存备用。1.5RT-PCR扩增RT-PCR扩增采用一步法。反应体系为25UL,其中：2X1StepBuffer12.5uL,PrimeScript1StepEnzymeMix1卩L,上游引物FluL,下游引物R1uL,RNA模板3PL,RNase-freeddH206.5»L。反应程序为：50°C反转录30min,95°C预变性lmin；94°C变性1min,52°C退火1min,72°C延伸1min,重复30个循环；72°C延伸10min；4°C保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6目的基因序列测定与分析RT-PCR扩增产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。测序结果与GenBank发表的JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株、NADC30株、SD1株、VR2332株的N蛋白基因序列进行比对，使用DNASTAR软件绘制进化树。