人脂肪干细胞分离培养及鉴定摘要目的：探索从健康成人脂肪组织中分离、培养并鉴定脂肪干细胞。方法：用健康成人的脂肪组织，剔除可见纤维结缔组织后剪碎，胶原酶法分离并体外培养脂肪干细胞，并进行流式细胞术鉴定。结果：可以从健康成人脂肪组织中提取出脂肪干细胞，体外环境扩增传代，流式细胞仪检测细胞表面高度表达CD29,CD44,CD105等，具有间充质干细胞特性。结论：可以从人脂肪组织中分离、培养出脂肪干细胞。关键词脂肪干细胞分离培养鉴定体外实验doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2011.08.004组织工程的一个研究重点，是种子细胞的来源。研究发现脂肪组织含有一种被称为ADSCs的细胞，它具有一般干细胞的特性，与骨髓干细胞相比，它具有明显优势，在来源、取材、扩增能力方面，都是骨髓干细胞所无法比拟的，可作为种子细胞应用于组织工程。材料与方法试剂与仪器：低糖DMEM培养液，I型胶原酶，胎牛血清，PBS缓冲液，0.25%胰蛋白酶，恒湿培养箱，倒置显微镜,细胞计数仪，流式细胞仪，低速水平离心机，超净工作台，CD29、CD44、CD105。脂肪组织来源：实验所用成人脂肪组织来自蚌埠医学院第一附属医院抽脂术的健康女性，年龄25〜45岁。脂肪干细胞的原代培养：无菌条件下提取脂肪组织约15g,PBS液洗去红细胞。眼科剪剔除脂肪组织中可见血管，剪碎至细小颗粒，0.1%I型胶原蛋白酶消化，1500r/分离心10分钟，去除脂肪细胞及上清液，D-hanks液重悬沉淀，200目细胞筛过滤，1500r/分离心10分钟，所得细胞提取物用含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬，以适当密度接种于无菌培养瓶中，在37°C.C02体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中孵育，5天后首次换液，之后3天换液1次，待原代细胞达85%融合时消化传代。脂肪干细胞的传代培养：原代培养细胞达到85%融合时,以0.25%胰蛋白酶将贴壁细胞消化分离3〜5分钟，1：2进行传代，接种于25ml培养瓶中，3天换液1次，当贴壁细胞接近融合时再次传代。光学显微镜下观察细胞生长及形态。流式细胞仪检测相关抗原：流式细胞仪对第3代脂肪干细胞表面相对特异性抗原进行检测。0.25%胰蛋白酶消化待检细胞，1500r/分离心10分钟，在细胞沉淀中（细胞数量约1X106）分别加入FITC-CD44荧光抗体，PE-CD29荧光抗体，APC-CD105荧光抗体各20ul,4°C孵育30分钟，再用PBS缓冲液清洗2遍，最后用10%福尔马林固定细胞，上机测定抗原的阳性率。脂肪干细胞的形态：将有脂肪干细胞贴壁的培养瓶口旋紧水平放置在倒置显微镜下观察，在原代细胞培养24小时后可见少量较大的呈梭形的脂肪干细胞贴壁，4天首次换液，细胞清晰可见，呈多角形、纺锤形，集落样生长。9天后细胞生长明显增加，呈涡旋状生长。从原代培养到第14天时可见细胞铺满瓶底80%左右。而传代细胞生长速度明显快于原代细胞。传代后细胞增殖明显加快，于第3天开始数量明显增多，5〜6天后细胞即已长满培养瓶底，细胞排列更加整齐有序，杂质细胞极少见。见图1、2o脂肪干细胞的表型特征：流式细胞仪分析第3代的脂肪干细胞的细胞表型，CD29阳性率为86%±2%,CD44阳性率为93%±1%,CD105阳性率为78%±2%O见图3。讨论脂肪干细胞的鉴定，尚无直接的方法。一般通过培养过程中出现的分化表型逆推得知。研究证实多种干细胞皆可表达CD44,用免疫组织化学方法检测细胞CD44阳性表达，表明细胞源自干细胞［1］。免疫荧光和流式细胞术检测显示，CD29、CD44、CD105、CD13是间充质干细胞的特征性表面标志。它们在脂肪干细胞中阳性表达说明脂肪干细胞具有间充质干细胞表型［2］。图3脂肪干细胞的表型特征陶凯等［3］通过不同血清浓度作用下生长曲线绘制发现，在血清浓度为15%和20%时，在最短时间内细胞可进入平台期，达到细胞增殖高峰期，综合考虑性价因素，实际应用中可将15%作为血清的最适宜浓度。通过两代生长曲线发现，第2代细胞较原代细胞更快进入增殖高峰，即细胞在最初传代后，生长加快，与实际培养中所见的适度传代促进增殖相一致。笔者在实验过程中也得到了相似的结论。需要强调的是，研究中采用的虽是公认的分离培养流程，但实际操作中得到的仍是一种混合细胞，其中混杂有部分前体细胞，如何纯化及怎样示踪和标记脂肪干细胞，是该领域亟需...