双缩脲法测定奶粉中的蛋白质含量【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用双缩脲法测定蛋白质的含量，在540nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。【关键词】奶粉；蛋白质；双缩脲法；标准曲线1【前言】蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，奶粉中蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多,如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用双缩脲法快速测定奶粉中的蛋白质含量。2实验目的（1）学习从奶粉中提取酪蛋白的原理和方法；（2）掌握利用双缩脲法对蛋白质含量的测定的原理和方法；（3）掌握利用分光光度法对物质的定性和定量测定的原理和方法；3实验原理3.1奶粉中提取蛋白质的原理奶粉中主要蛋白质是酪蛋白，每100克婴幼儿奶粉中含12克～25克。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将奶粉用蒸馏水溶解，然后将其PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯酪蛋白。3.2双缩脲测定蛋白质的原理当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围1-10mg4实验设备可见光分光光度计1台、离心机1台、电热器1台、电子天平（0.01g）1台、pHS-3C酸度计1台、烧杯、试管15支、漏斗、移液管若干、胶头滴管2~3支、离心管等。5实验材料和试剂5.1材料与试剂奶粉，双缩脲试剂，体积分数95%乙醇120ml，无水乙醚120ml，0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液牛血清白蛋白标准溶液蒸馏水5.2缓冲液的配制缓冲溶液300ml（先配置A液和B液）A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称NaAc·3H2O5.44g，定容200mlB液（0.2mol/L醋酸溶液）：称优级纯醋酸（含量大于99.8%）2.4g，定容至200ml取A液177Ml，B液123ml，混合既得PH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液300ml操作6奶粉中真蛋白含量的测定6.1标准应用曲线的绘制操作步骤：1.取15支试管，按下表编号、加试剂（做2个平行组）管号0123456样品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白体积(mL)00.30.61.21.82.43.0－待测液体积(mL)－－－－－－－3.0*蒸馏水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混合后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。4.以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。:6.2样品制备与测定1.称取一定量的奶粉，用蒸馏水将其溶解至饱和2.将100ml奶粉溶液加热至40℃，在搅拌下慢慢加入预热至40℃、PH4.7的醋酸缓冲溶液，用精密PH试纸或酸度计调PH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15min(3000r/min)，弃去上清夜，得酪蛋白粗制品（或用细布过滤，收集沉淀）3.用水洗沉淀3次，离心10min(3000r/min)，，弃去上清夜4.在沉淀中加入30ml体积分数95%乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽虑，用乙醇-乙醚混合液（乙醇和乙醚按1：1等体积混合）200ml洗沉淀2次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。5.将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品.6.用生理盐水溶解提取的蛋白质，取3.0ml的待测液与双缩脲试剂反应，再用光分光光度计测其吸光值。6.3分析结果的表述与计算根据标准曲线，查出对应吸光值的待测液的蛋白质浓度，在乘以稀释的倍数，再计算其质量，再除以奶粉的质量，即得奶粉的蛋白质的质量分数。7.讨论奶粉中蛋白质...