针对糖尿病易感基因V13的慢病毒系统的建立及其对T细胞的转导

针对糖尿病易感基因VB13的慢病毒系统的建立及其对T细胞的转导DOI:10.7504/nk2016010203屮图分类号:R587.1文献标识码:A摘要:目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默连接红色荧光蛋口mCherry与靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表达,建立一种简便有效基因沉默的系统,并初步研究慢病毒感染T细胞的可能性。方法:以Vβ13mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向Vβ13的shRNA表达质粒,构建携带Vβ13的mCherry红色荧光蛋口的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞。通过红色荧光的表达及RT-PCR和WesternBlot确定最佳沉默Vβ13序列后,将有效的UTG・Vβ13质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,低温超高速离心,获取高滴度慢病毒。应用慢病毒感染大鼠T细胞,光镜观察T细胞被慢病毒感染的情况,流式细胞术检测T细胞的绿色荧光表达情况。结果:成功构建Vβ13-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-Vβ13,RT-PCR及WesternBlot结果显示慢病毒感染的293FT细胞Vβ13mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低。构建的慢病毒可以成功感染T细胞。结论:红色靶基因■绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率。可作为一种良好的基因导人载体,实现慢病毒介导的RNA干扰在T细胞内的有效表达,并为T细胞过继性转移的相关研究提供技术支持。关键词型糖尿病,慢病毒,绿色荧光蛋口,红色荧光质粒,Vβ13AnEGFP-LentivirusandredtargetVβ13genesystemanditsinfectioninratTcellsLIUZhi-Jun*lCHENYong2LIWen-Tong3WANGJin・DonglLIJiao4JIANGZi・Tong5LIFeng・Jie1.MicrobiologyDepartment,WeifangMedicalUniversityShandongWeifang2610532.BiochemistryDepartment,WeifangMedicalUniversityShandongWeifang2610533.DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversityShandongWeifang2610534.BiologicalScienceandTechnology,Biopharmaceuticalclass2015thWeifangMedicalUniversityShandongWeifang2610535.ClinicalMedicine,2014th,WeifangMedicalUniversityShandongWeifang2610536.CentralLaboratory,WeifangMedicalUniversityShandongWeifang261053Abstract:[Objective]RNAinterferieneetechnologymediatedbyLentiviruswasappliedtoeffectivelysileneethemCherrycombinedVβ13targetgeneexpressionandapossibilityinLentivirustransductionNSCswasexploredpreliminarily[Methods]TheVβ13genemRNAsequencesweresetasinterferedtargetsandaLentiviruscassettenamedUTGwasusedasvectorinproducingLentivirustoconstructshRNAexpressiveplasmid.AmCherryplasmidcarryingthewholebackboneofVβ13genewassetasthetargettoshRNAs.BoththeUTGandmCherry・Vβ13plasmidswereco-transfectedinto293FTcells.TheoptimizedVβ13sequeneewasdeterminedbyknockingoutofmCherrycolorandconfirmedbyRT-PCRandWesternBlot,theUTG-shVβ13plasmidwasco-transfectedwiththehelperplasmidsinto293FTcellsforLentivirusafterasuperhighspeedcentrifugein4°C.Subsequently,theLentiviruswasaddedintoTcellstoobservethesituationoftransduction.FACSwasappliedtoobserveanddetecttheEGFPproteinexpression.[Results]AsetofLentiviralshRNAvectorstargetingVβ13wasconstructedsuccessfullyandoneoptimizedshRNAsequeneewasselectedbyRT-PCRandWesternBlot.TheresultsshowedVβ13mRNAandproteinweredecreasedsign讦icantly.Inaddition,LentiviruswithshRNAcaninfectratTcells.[Conclusion]ThemCherrytarget-EGFPLentiviruscharacterizesassimpleandconvenienttoolinscreeninganoptionalshRNA;UTGLentivirusshowsahighefficiencyininfectingTcellsasavectortostudyknockingdowngeneexpressioninTcells.Keywords:Type1diabetes,,Lentivirus,greenfluorescentprotein,mCherryplasmid,Vβ13geneRNA干扰和慢病毒技术是通过用shRNA沉默转染质粒和细胞相关基因的表达,在目前已经成为检测基因...

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