食品安全国家标准食品中生物素的测定1范围本标准规定了食品中生物素的测定方法。本标准适用于食品中生物素的测定。第一法微生物法2原理（指方法的基本原理，或方法的特性。）生物素是植物乳杆菌Lactobacillusplantarum（ATCC8014）生长所必需的营养素。在一定条件下，利用样品和标准品在生物素测定培养基中生长产生的光密度来测定生物素的含量。3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。3.1试剂3.1.1无水乙醇（C2H6O）。3.1.2氢氧化钠（NaOH）。3.1.3氯化钠（NaCl）。3.1.4盐酸（HCL）。3.1.5柠檬酸盐。3.1.6-淀粉酶：≥1.5u/mg。3.1.7硫酸（H2SO4）。3.2试剂配制3.2.1乙醇溶液（50%）：量取500mL无水乙醇与500mL水混匀。3.2.2氢氧化钠乙醇溶液（0.5mol/L）：称取20g氢氧化钠，溶于1000mL水中，混匀。3.2.3氯化钠溶液（0.85%）：称取8.5g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。3.2.4盐酸溶液（1mol/L）：吸取83mL盐酸，用水稀释至1000mL，混匀。3.2.5柠檬酸盐缓冲液（pH值4.5）：称取1.5g柠檬酸至一个100mL带磁力搅拌器的烧杯中，加入约50mL蒸馏水至溶解，再加入12mL的NaOH（1mol/L），调整pH值至4.5（用0.1mol/LHCl），将溶液转入100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容。该缓冲液可在2-8°C储存3天。3.2.6蛋白酶-淀粉酶液：分别称取200mg木瓜蛋白酶和-淀粉酶，加入20mL水研磨至匀浆，3000r/min离心5min～10min。现用现配。3.2.7硫酸溶液（3%）：量取30mL硫酸加入到1000mL水混匀。3.3标准品3.3.1生物素生物素（d-Biotin或VitaminH）标准品（C10H16N2O3S）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制3.4.1生物素标准储备液（80μg/mL）：精确称取80mg生物素标准品，用乙醇溶液（50%）溶解并转移至1000mL容量瓶中，定容至刻度。储存于棕色瓶中，于2℃～4℃冰箱保存1年。3.4.2生物素标准中间液（0.8μg/mL）：准确吸取1.00mL生物素标准储备液置于100mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液（50%）稀释并定容至刻度，混匀后储存于瓶中2℃～4℃冰箱保存6个月。3.4.3生物素标准工作液（8ng/mL）：准确吸取1.00mL生物素标准中间液置于100mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀。临用前现配。3.5培养基3.5.1乳酸杆菌琼脂培养基：可按附录A配制，也可直接购买商品化合成的乳酸杆菌琼脂培养基，按其标识配制。3.5.2乳酸杆菌肉汤培养基：可按附录A配制，也可直接购买商品化合成的乳酸杆菌肉汤培养基，按其标识配制。3.5.3生物素测定用培养基：可按附录A配制，也可直接购买商品化合成的生物素测定用培养基，按其标识配制。4仪器和设备4.1天平：感量0.1mg。4.2恒温培养箱：36℃±1℃。4.3压力蒸汽消毒器：121℃(0.10mPa～0.12mPa)。4.4漩涡振荡器。4.5离心机：转速≥2000r/min。4.6接种针和接种环。4.7pH计：精度±0.01。4.8酶标仪（610nm-630nm或540nm-550nm）。4.9超净工作台。4.10可调式电炉。4.11微量移液器10μL–100μL；20μL–200μL；100μL–1000μL。4.12无菌旋盖离心管（1.5mL和50mL）。4.13无菌0.22μm或0.45μm过滤膜。4.14无菌注射器。4.15无菌微孔板。4.16无菌贴膜。5菌种的制备与保存5.1菌种：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum（ATCC8014）。5.2储备菌种的制备将菌种植物乳杆菌Lactobacillusplantarum（ATCC8014）转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20h～24h，取出后放入2℃～4℃冰箱中保存。每月至少传种一次，作为储备菌株保存。将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20h～24h以活化菌株，用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2～3代以保证细菌活力。6分析步骤（所有操作均需避光进行）6.1试样制备谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3mm～0.5mm)；肉、蛋、鱼、坚果等用打碎机制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。4℃冰箱保存，1周内测定。6.2试样提取6.2.1薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、藻类试样、蛋类、豆类、坚果类、动物内脏等天然食品。准确称取1g（ml）均质样品至一个50ml锥形瓶中，加入30...