皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察【摘要】目的：从皮肤组织块培养获取原代细胞。方法：将皮肤组织块修剪成2mmX2mm大小，放置到培养皿中，真皮层向下，观察细胞爬出的情况。结果：组织块培养第3天，有角质形成细胞从组织块爬出，第7天左右组织块周围出现黑素细胞，随着培养时间的延长，组织块周围出现大量成纤维细胞。结论：在组织块培养过程中，早期可以收集较纯的角质形成细胞，含血清的DMEM培养20d后，可以得到大量成纤维细胞。【关键词】组织块培养；原代细胞；前体细胞【】Q813.1【文献标志码】A【】1008-6455（2015）06-0034-03皮肤原代细胞的获得与培养对于基础和临床研究有着重要的意义。然而，通过中性蛋白酶和胰酶消化将表皮细胞游离，然后进行细胞的贴壁培养，继而经差别胰酶消化将细胞纯化，得到的角质形成细胞容易受到成纤维细胞的污染。在本实验中，通过皮肤组织块的培养方法，通过不同细胞从组织块爬出的时间不同，探索获得原代细胞的方法。1材料和方法1.1材料1.1.1包皮：包皮环切术中的包皮组织（提供者为18岁健康男性）1.1.2试剂：中性蛋白酶（sigma），0.05%及0.25%的胰酶/0.53mmol/LEDTA（吉诺牛物公司），人黑素细胞培养基（Medium254）及黑素细胞牛长添加成分（humanmelanocytegrowthsupplement，HMGS）（包含5μg/ml胰岛素，50μg/ml维生素C，6mmol/LL一谷氨酰胺，0.20mmol/L氯化钙等），人表皮细胞无血清培养基，角质形成细胞牛长添加成分（humankeratinocytegrowthsupplement，HKGS）（0.18μg/ml氢化可的松、0.20ng/mlEGF、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素和8μg、ml霍乱毒素）（美国Invitrogen公司），胎牛血清（四季青）（浙江天航牛物科技有限公司），兔抗人Vimentin单克隆抗体（福州迈新牛物科技有限公司），GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒（上海基因科技有限公司）。1.2方法1.2.1组织块培养：碘伏浸泡包皮标本lOmin，磷酸盐缓冲液（PBS，含400U/ml青霉素和400U/ml链霉素）将碘伏冲洗干净，修剪皮下组织，在接近表真皮交界处，将皮肤组织块剪成约2mm×2mm大小，放置到培养皿中，真皮层向下。将含有20%胎牛血清的DMEM少量分别滴加到组织块表面，液体量刚好将组织块浸润，置入37℃孵箱中。第2天，待组织块贴紧培养皿底壁后，添加的液体换成含HKGS的表皮细胞培养基（不含血清）。每天适当添加培养基，使得组织块不会因液体少而干，而不会因液体多而漂浮，分别观察组织块的变化。1.2.2细胞爬片：组织块培养20d后，将残余的组织块挑除，胰酶消化贴壁的细胞，中和后获得单细胞悬液，重新种植并进行部分细胞爬片。爬片3d后，细胞贴壁生长，进行免疫细胞化学染色。1.2.3免疫细胞化学染色：PBS润洗细胞爬片，4%多聚中醛固定lOmin，PBS冲洗，0.1%的triton-100溶液细胞通透lOmin，PBS冲洗，20%的胎牛血清室温下封闭20：-30min，PBS冲洗，加一抗Vimentin抗体（1：50稀释），4qC过夜，复温30min，PBS冲洗，含HRP的通用型二抗孵育30min，PBS冲洗，DAB显色液显色，显微镜下观察，终止，摄片。2结果2.1细胞牛长情况培养皿中组织块培养第3天开始，有角质形成细胞爬出，随着时间的延长，细胞爬行到离组织块的距离越远（见图1）。培养7d左右，有树突状细胞爬出，树突状细胞在角质形成细胞间隙中爬行，甚至游离到超出角质形成细胞的范围（见图2），可以推断为黑素细胞。部分树突状细胞呈簇状从组织块周围爬出，细胞多呈现双树突，棒槌样（见图3），穿过角质形成细胞，部分呈细胞成团样分布（见图4）。2.2组织块培养20d后随着含血清的DMEM培养基培养组织块时间的延长，逐渐出现细胞网状牛长，培养20d后，大量梭形细胞，形态难以区别是黑素细胞还是成纤维细胞（见图5）。胰酶消化获得单细胞悬液贴蹙牛长后进行免疫细胞化学染色，结果示：细胞呈不规则网状分布，波形蛋白抗体染色阳性（见图6），可以表明细胞均为成纤维细胞。3讨论在本实验中，皮肤组织块培养第3天左右，角质形成细胞从组织块周围爬出，无其他细胞混杂，此时胰酶消化可以得到较为纯净的角质形成细胞，不受成纤维细胞污染。这种皮肤组织块培养法可以获取原代角质形成细胞，用于大面积烧伤的...