动力学光度法测定血清中谷氨酸脱氢酶摘要建立了血清中谷氨酸脱氢酶的催化动力学测定新方法。该方法的特异性、精密度和准确度均能达到临床检验的要求。关键词动力学光度法谷氨酸脱氢酶血清中分类号：O657.32文章编号：1004-4337(2000)02-0111-02谷氨酸脱氢酶(GLDH)为肝线粒体特异性酶，主要分布于肝、小肠、心肌、肾及肺等器官组织，在肝细胞中的含量最高［1］。有关文献［2，3］指出，当肝细胞损伤或坏死量，GLDH进入血液，且其活性大小与肝细胞损伤程度呈正相关。故测定血中GLDH的活性对于肝脏病变尤其对坏死型肝病的临床诊断意义重大。测定GLDH活性的方法报道很少。已见报道的主要有可见催化光度法和紫外催化动力学光度法。前者操作麻烦费时，不适合于临床检验；后者敏感度、特异性、准确度和精密度均高于前者，但所需仪器设备价格昂贵，难以在中、低级医院推广应用。本文提出的动力学光度法测定血清中GLDH活性的方法，简便易行，既能用手工快速操作，又能在自动生化分析仪上进行检测，且两者测定结果无显著性差异。1实验部分1.1仪器754型分光光度计；SecomanS500P型半自动生化分析仪；生化培养箱。1.2试剂0.08mol/LTris-盐酸缓冲液，双蒸水配制，pH8.5；18mmol/L腺苷二磷酸钠盐(ADP)溶液，视用量配制，冰藏；3mmol/L还原型辅酶Ⅰ二钠盐(NADH)溶液，视用量配制，0℃保存可稳定10天；0.135mol/Lα-酮戊二酸溶液，双蒸水配制；2.85mol/L氯化铵溶液，双蒸水配制。将上述各试液按下列体积比进行混合：Tris-盐酸溶液+α-酮戊酸溶液+ADP溶液+NADH溶液=10+1+1+1，临用前配制。1.3实验方法1.3.1手工操作法在10ml试管中加入2.60ml混合溶液，200μl血清，摇匀后加入0.20ml氯化铵溶液，充分混匀，于37℃恒温水浴箱中孵育至2min，340nm处以1cm比色杯，用空白调零，测吸光度(A1)。取出测定管再置于37℃准确孵育至5min，测定吸光度(A2)。由两次测定值求平均每分钟吸光度的变化值△A/min=(A1-A2)/3min，按下式计算GLDH的活性：GLDH(IU/L)=(△A/min)×(106/6220)×(反应液总体积/血清体积)=2.4×103(△A/min)1.3.2自动测定法向半自动生化分析仪进行440μl混合溶液，30μl血清，30μl氯化铵溶液。选定生化分析仪测定条件为：温度37℃，波长340nm，延滞时间2min，速率时间3min，间隔时间30s，空白调零，由打印的结果求得平均△A/min，按上式计算GLDH的活性。(说明：①单位定义：1L血清每分钟转化1μmol低物的酶量为1IU；②6220为NADH在340nm的摩尔吸光系数。)2结果与讨论2.1正常参考值对49名健康输血者(男28例，女21例)血清GLDH活性进行测定，结果处理及正常参考值见表1(表中数据均为手工操作法测定结果)。表1正常人血清GLDH活性测定结果及正常参考值男28例女21例x+s4.11±2.603.70±2.23范围1.25～9.781.06～9.04正常参考值(x+2s)0～9.310～8.162.2酶促反应时间取GLDH活性较高的血清样进行测定，结果表明，孵育时间在0～2min范围内吸光度随时间变化差异较大；孵育时间为2～8min吸光度变化值与时间成良好的线性关系；孵育8min后，吸光度基本不变。本实验在手工操作时确定2min和5min两测定点的吸光度来计算酶的活性；自动分析法选定延滞时间为2min，在2～5min范围内每隔30s测定一次。2.3酶促反应最适pH配制不同浓度的缓冲液，在pH7.5～9.5范围内，每隔0.2pH为一测定点，结果表明，pH在8.5±0.2范围酶的活性最大；pH在7.7～9.0范围内酶的活性变化较小，本实验选定酶促反应pH为8.5±0.2。2.4试液浓度的选定当反应液α-酮戊二酸浓度为7～11mmol/L，NADH浓度为0.15～0.26mmol/L，ADP浓度为1.0～1.5mmol/L，Tris-盐酸浓度为5.0～5.7mmol/L,NH+4浓度为0.15～0.23mol/L时，酶的活性基本不变。本实验所取上述各试液的浓度分别为9mmol/L、0.2mmol/L、1.2mmol/L、5.3mmol/L和0.19mol/L。2.5空白管的选定一般情况可以选用蒸馏水调零，但为了使吸光度在误差较小的标示值范围读数，本实验用组成为Tris-盐酸溶液+α-酮戊二酸溶液+蒸馏水=4+1+1的溶液调零，提高了测定准确度。2.6特异性试验用两种操作方法测定了38例非肝病住院病人血清，GLDH活性高于正常值上限且范围在8.16～9.36IU/L者为2例，阴性期望值为94.7%；...