常见三种胆结石胆汁中的微生物群落的差异性对比徐斌(上海市浦东新区人民医院上海201299)【摘要】目的：探讨常见的三种胆结石胆汁中微生物群落的差异性对比。方法：选择2011年3月一2013年3月我院收治的三种类型胆结石患者100例作为研究对象，对其运用末端限制性片断长度多态性(T-RFLP)技术，并对其胆汁细菌群落进行基因序列分析探讨。结果：根据统计结果来看，就细菌16SrDNA基因片段而言，其阳性检岀率为76%,且三组间的差异比较无统计学意义，胆色素结石组主要包括厌氧消化球菌等，胆固醇组的细菌群落以金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌为主，混合性结石胆汁组主要是丙酸杆菌和厌氧消化球菌。结论：据我院统计分析看来，就检出率方面来看，较高的是胆结石患者胆汁标木中的细菌,但各组细菌群落构成各有不同，具有较为复杂的成分【关键词】微牛物群落；胆结石；差异性【中图分类号】R31【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2015)16-0063-02近年来，我国的胆结石发病率呈逐渐上升趋势，目前约为5.6%,就其发生机制方面来看，己然从胆汁郁滞、肺道感染及胆汁理化性质紊乱发展为了胆囊内微牛物环境的改变，基于此，我院选择收治的三种类型胆结石患者，并利用末端限制性片断长度多态性技术对患者的胆•囊内微牛物菌落16SrDNA进行了统一分析，现报告如下：1.资料和方法1.1一般资料选取我院2011年3月〜2013年3月收治的100例三种类型胆结石患者为研究对象，其均接受择期胆囊切除术，其中另36例，女64例，患者的平均年龄为55岁，我院结合对胆石化学成分用红外光谱法的分析，将患者分为三组，分别为混合性结石组28例，纯胆固醇结石组50例，另外，有22例为胆色素结石组。1.2主要仪器和试剂为了提高实验的准确性，用了ABI3100全自动遗传分析仪、ABI2720PCR热循环仪、ZF型紫外分析仪以及低温高速台式离心机MR23i等，Hi-Di甲酰胺，LizSOO和细菌16SrDNAPCR扩增试剂盒。1.3胆汁DNA的提取研究中，取胆汁1ml与lmIBufferI,并涡旋振荡充分混匀，在此基础上，加入溶菌B(50g/L)100&mu;l,在37°C下培育lh,并将离心管置于液氮中5min,继而迅速向水浴锅(65°C)转移，进行3min解冻，进行反复3次，接下来加0.5mlbufferII,上下摇匀后，向其中加蛋白酶K共5&mu;l,进行lh水浴。完成上述操作后，按照1:1比例向上述溶液中加入比例为25:24:1的加酚/氯仿/异戊醇混合液，离心5min,用一灭菌塑料离心管吸上层水相800&mu;l,并将上述三种的混合液进行等体积加入，加入两倍体积的无水乙醇，离心30min,13000r/min,继而将上清去弃去，进行真空干燥后，将30〜50&mu;ITE缓冲溶液加入其中，对DNA进行充分溶解，并保存于・20°C的条件下。1.4T-RFLP分析在此环节，我院研究人员将0.2&mu;l的Uz500>10&mu;lHi-Di甲酰胺与纯化、酶切后的PCR产物进行混合，继而于ABI3130遗传分析仪中实施毛细管电泳，所取基线的荧光强度50RFU,并对大于基线的峰高和出峰处的T—RF长度用Genemapper软件进行计算,标准化处理大于50bp的峰面积,对其丰度进行计算，完善整个过程。1.5克隆文库的构建、测序研究中，借助于非荧光标记的引物，PCR扩增各组阳性样品的细菌16SrDNA片段，继而采用E.coliDH5&alpha;菌株和pGEM-Teasy载体、进行细菌16SrDNA文库的建立，在此基础上，对细菌克隆文库中随机挑选的阳性克隆利用PCR-T-RFLP分析进行分型筛选，然后进行测序，在此基础上获得细菌16SrDNA部分序列，接下来用Blast与GenBank中核酸数据实施序列比对，完成整个分析。1.6统计学处理本次研究中，我院在统计分析方面采用了SPSS17.0统计学软件，率的比较采用FisheryExacttest分析来进行，试验中三组间差异比较具有统计学意义用P<0.05表示。2.结果研究统计结果显示，参与研究的：L00例患者中，检出细菌16SrDNA基因片段的有76例，所以其对应的阳性率达到了76%,三组中纯胆固醇结石胆汁组阳性检出率为80%,混合性结石胆汁组为78.5%(22/28),胆色素结石胆汁组为63.6%(14/22),三组阳性检测率比较差异不具统计学意义(P>0.05)o本次研究中，在胆汁细菌16SrDNAPCR的T—RFLP分析方面。较高的是胆结石患者胆汁标本中的细菌，但各组细菌群落构成各有不同，具有较为复杂的成分。3.讨论本次研究...