核桃树皮提取物对新生血管生成的影响李佳，张洁雨，李岩*（北京理工大学生命科学与技术学院药学系，北京100081）摘要目的考察核桃树皮提取物(HT)对新生血管的抑制作用，并初步探讨可能的靶点和作用机制。方法体外采用MTT法考察核桃树皮提取物对人脐静脉细胞增殖、迁移和对肿瘤细胞黏附的影响。体内采用鸡胚尿囊膜法，考察核桃树皮提取物对新生血管的影响结果核桃树皮提取物可以明显抑制ECV304细胞的增殖和迁移，并且呈一定的浓度和作用时间的依赖性，同时也可以大大降低肿瘤细胞对ECV304的粘附能力，并且抑制CAM血管生成，使血管分支数明显减少。结论核桃树皮提取物可以抑制新生血管生成。关键词:核桃树皮有效成分血管生成CAMStudyontheeffectofJuglansmandshuricamaxinonAngiogenesisLI激a,ZHANG激e-yu,LIYan*(SchoolofLifescienceandTechnologyofBeijingInstituteofTechnology,Beijing,100081,China)Abstract:ObjectionTostudytheInhibitionofofJuglansmandshuricamaxim(HT)onangiogenesisMethodsTheeffectofHTonthegrowthofHumanumbilicalveincells(ECV304)andtheadhesionofHumanumbilicalveincellstotumorcellswereevaluatedbyMTT;checkedtheeffectofHTonangiogenesisbyEmbryoallantoicmembrane.ResultsHThadtheinhibitoryeffcctontheprolifcrationofECV304cells,reducethetumorcelladhesiontotheECV304,inhibitCAMangiogenesisandreducethenumberofbranches.ConclusionHTextractcaninhibitangiogenesis.Keywords:Walnuttreebarkactiveingredients;Angiogenesis;CAM血管新生(Angiogcncsis)是指在原有血管的基础上通过内皮细胞的增殖、迁移长出分支血管的过程。在生理情况下，血管新生在个体的发育以及伤口愈合作者简介：李佳（1981-），男，硕士研究生，主要从事中药抗肿瘤机理研究*通讯作者：李岩（1958-）女，教授，主要研究方向肿瘤、免疫药理学，新药药理学等研究。E-mail:leeyan@bit.edu.Tel:010-68912140。中起着重要作用[1,2，3]。很多疾病的发展会导致血管新生异常，比如糖尿病、风湿性关节炎、肿瘤等。特别对少数实体瘤来说，血管新生是其进一步生长、转移的必要条件[3]。因此，抑制肿瘤血管新生过程成了抗肿瘤的主要内容之一。我们采用通过检测核桃树皮提取物(HT)对ECV304细胞的增殖、迁移和对肿瘤细胞黏附的作用，以及通过经典抗肿瘤血管生成的体内实验-鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成实验观察了HT对血管生成的抑制作用。1材料和方法1.1药品、试剂及仪器核桃树皮提取物(HT)核桃树皮有效成分本院药学系药学组提供。DMEM，批号：1019564GIBCO公司；小牛血清，杭州生物工程公司，批号：6008D；Trypsin，(1:250),AgaroseAmresco公司；二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT，Amresco)；XDS-I倒置式光学显微镜（重庆光学仪器厂）；荧光显微镜LD5-2A型低速离心机北京医疗器械厂；MK3型酶标仪芬兰雷渤公司；XB-K-25型血细胞计数板玉环县求精医用仪器厂。11.2细胞培养人宫颈癌HeLa细胞：由北京师范大学生命科学与技术学院细胞室提供。人脐静脉内皮细胞ECV304：由军事医学科学院惠赠。以含10%小牛血清的DMEM常规培养，置于37℃、5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。1.3细胞增殖抑制检测1.3.1细胞毒实验(MTT法)[4]取对数生长期的HeLa细胞，台盼蓝排染法计数活细胞数，DMEM培养液调整细胞密度为1.0×106cells·l-1。以190μl·well-1，将细胞接种到96孔板中，细胞接种后置37℃，5%CO2，100%湿度的培养箱中培养12h。分别加入含不同药物浓度的培养基10μl，每组设5复孔，同时设立阴性对照（空白试剂）和不加细胞只加培养基的空白对照。HT的8个终浓度为10、20、50、100、200、400、800、1000μg·ml-1,继续培养24h后，MTT法570nm处检测OD值，SPSS13.0软件分析得到药物作用24h的IC50.1.4细胞迁移抑制检测挑选处于对数生长期的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化、离心（800～1000rpm×5min），制成单细胞悬液，然后计数细胞，并调整细胞密度为5.0×104·ml-1。将细胞接种到6孔板中，每孔3ml，细胞接种后置37℃，5%CO2，100%湿度的培养箱中培养24h。待细胞长成单片后，用200ml移液...