基于RNAi技术抗黑条矮缩病水稻新品系的培育朱文银徐建第杨连群姜明松摘要：水稻黑条矮缩病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV）由介体灰飞虱以持久性不经卵方式传播。该病毒引起的水稻黑条矮缩病分布范围广、危害重。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是近年来发现的一种重要的植物抗病毒基因工程策略，已广泛应用于植物抗病毒研究中。本研究利用已构建的包含P10CP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的RNAi双元表达载体pRBSDV-CP3-bar，采用农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得抗黑条矮缩病和抗除草剂的转基因水稻植株，通过抗性筛选、PCR检测及分子杂交分析，获得2个抗RBSDV和Basta的稳定品系，并对其田间抗性及农艺性状表现进行了鉴定，为抗RBSDV水稻新品种（品系）的培育奠定了基础。关键词：水稻黑条矮缩病毒；RNA干扰；反向重复序列；农杆菌介导：S511.035.3文献标识号：A：1001-4942（2018）11-0023-05AbstractRiceblack-streakeddwarfvirus（RBSDV）istransmittedbythesmallbrownplanthopper（SPBH，LaodelphaxstriatellusFallen）persistently.Riceblack-streakeddwarfdiseaseisoneofthemostwidespreadandseverevirusdiseases.RNAinterference（RNAi）isanimportantgenesilencingphenomenonandhasbeenwidelyusedinthetransgenicbreedingforimprovingcropsviralresistantce.AccordingtotheprincipleofRNAinterferencemechanism，anewRNAibinaryvectornamedpRBSDV-CP3-bar，wasconstructedincludingtheinverted-repeatsequenceofP10CPgenepartialfragmentandthemarkergenebarwithhigherbiosecurity，andwasusedtotransformricecallusmediatedbyAgrobacteriuminordertoobtainanti-RBSDVandherbicide-resistanttransgenicriceplants.AfteranalyzedbyPCRandnorthernblot，twoanti-bastaandhighlyRBSDV-resistantricevarietiesKRBSDV2andKRBSDV6wereobtained.Theirperformanceoffieldresistanceandagronomytraitswereinvestgated.Itlaidafoundationforthebreedingofnewricevarieties（lines）resistanttoRBSDV.KeywordsRiceblack-streakeddwarfvirus；RNAinterference；Inverted-repeatsequences；Agrobacterium-mediated水稻黑条矮缩病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV）是引起水稻黑条矮缩病的病原物，该病毒属呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）成员之一[1]。RBSDV主要由昆虫介体灰飞虱（LaodelphaxstriatellusFallen）以持久性不经卵方式传播，除侵染水稻外，还能侵染玉米引起玉米粗缩病[2]。水稻受该病毒侵染后主要表现为植株矮小丛生，不发棵，叶片细小浓绿，叶背、叶鞘和茎秆有早期蜡白色、后期黑褐色的短条纹不规则突起，严重发病株不能正常抽穗。发病田塊一般减产10%～40%，重病田甚至颗粒无收[3-6]。近年来，在黄淮流域粳稻区由于耕作制度和耕种方式的变化，灰飞虱冬前虫量基数逐年增长，由于田间杂草和禾本科作物可作为RBSDV的寄主，通过灰飞虱的食毒和传毒，该病很有可能在黄淮流域粳稻区大发生，对水稻生产构成新的威胁。江苏、山东、河南等省份一直将参试水稻品种的黑条矮缩病抗性鉴定结果作为新品种审定标准的重要约束性指标之一。目前生产上主要依赖化学农药控制介体灰飞虱来防治RBSDV，但由于灰飞虱的迁飞习性及传毒的瞬时性，化学防治效果不明显，且易造成环境污染。因此，选育抗病品种是防治水稻黑条矮缩病最为经济有效的方法。RBSDV基因组分子量约占病毒粒子总分子量的15%～20%，其由10条双链RNA（doublestrandRNA，dsRNA）片段组成，按照其在聚丙烯凝胶电泳上的迁移距离由小到大，依次命名为S1—S10[7]；S1—S10编码蛋白功能已经基本明确，主要是RNA依赖的RNA聚合酶、外壳蛋白、沉默抑制子等[8-10]。其中，S10编码的63000蛋白质（P10）为病毒主要外层衣壳蛋白（coatprotein，CP）。P10蛋白质在体外或酵母细胞内都能通过N端230个氨基酸相互作用形成多聚体。进一步研究结果表明，纯化的P10蛋白在溶液中主要形成三聚体。P10蛋白形成三聚体的结构对于RBSDV病毒粒体衣壳的组装、复制及病毒传播具有重要作用[1...