・38・微生物学通报2005年32(1)紫外线诱变选育高产PHB解聚酶的菌株次素琴陈珊333刘东波夏红梅(东北师范大学生命科学学院长春130024)β羟基丁酸酯(PHB)的青霉(Penicilliumsp1)DS9713a为出发菌株,通摘要:以降解聚2过紫外线(UV)诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶复筛,获得酶活高于原始菌株的突变株5株,其中DS9713a2CS01突变株的PHB解聚酶活力高于对照97142%,并对其酶学性质进行了初步研究。β羟基丁酸酯解聚酶,DS9713a菌株,紫外线诱变关键词:聚2中图分类号:Q939196文献标识码:A文章编号:025322653(2005)0120038206SelectionHigh2YieldPHBDepolymeraseProducingStrainwithCISu2QinCHENShanLIUDong2BoXIAHong2(SchoolofLifeScience,NortheastNormalUAbstract:Conidialsuspensionwasobtainedfrsp1whichcoulddecomposePHB1Throughscreeningalotofmutantswiththetranszonesandflaskculture,fivestrainswerese2lectedfromstartingstraintreatedwithUVandactivitywerehigherthantheoriginal1ThebestmutantstrainnamedDS9713a2CS01,itπsenzymeactivitywasas197142%highasthatoftheoriginal,furthermore,thechar2actersofcrudeenzymewerestudied1Keywords:Poly(β2hydroxybutyrate)depolymerase,DS9713astrain,UVmutationβ羟基丁酸酯(PHB)是微生物在非平衡生长状态下胞内合成和积累的碳源和聚2[1]能源的储藏物质,以内含体的形式存在,可达细胞干重的90%。PHB除了具有高聚物的基本性质外,其可生物降解性和生物相容性倍受人们关注,因此作为一种新型的可生物降解高分子材料具有广泛的应用前景。[2,3]PHB的生物降解归因于许多细菌和真菌能够分泌胞外PHB解聚酶。国外从60年代陆续开展了有关降解PHB的工作,但绝大部分菌株是近些年来获得的。这些菌株对PHB具有很好的降解作用,所分泌的PHB解聚酶的最适pH为515～918,最适温度在30℃～55,℃但是,解聚酶对温度和pH稳定性未见报道。近几年,我国学者也开[4]展了PHB生物降解的研究工作,分离和筛选出了十几种可降解PHB的菌株,并对其[5～8]降解特性和酶学性质进行了比较深入的研究。但是,直接用从自然界中筛选的菌种产生的PHB降解酶的活性比较低,降解PHB的速度比较缓慢。如果能够通过物理或化学等方法对已有PHB降解菌株进行诱变,使其发生基因突变,实现大幅度提高降解PHB的酶活,不论从学术上还是从应用上都具有重要意义。本项工作就是在已有的可降解PHB菌株的基础上,通过紫外线诱变,获得了高产PHB解聚酶的菌株,并进一步3国家自然科学基金资助项目(No129774031,29834102)ProjectGrantedByChineseNationalNaturalScienceFund(No129774031,29834102)33[1]联系人Tel:043125709634,E2mail:chens093@nenu1edu1cn收稿日期:2004203215,修回日期:20042062302005年32(1)微生物学通报・39・研究了解聚酶的基本性质。1材料与方法111菌株青霉(Penicilliumsp1),编号DS9713a,为本实验室保藏菌株。112PHB由中国科学院微生物研究所提供,是微生物发酵的白色粉末,熔点17318,℃相对5分子质量7131×10。[9]113培养基PHB0115g,MgSO4・7H2O0105g,NH4Cl011g,CaCl2・2H2O015mg,KH2PO401554g,Na2HPO4・12H2O11194g,定容至1L,pH618114PHB粉末降解速率的测定(点植培养法)将无菌接种环蘸以极少量的孢子,点植于平板培养基上适当位置,等边三角形的3个顶点上。将培养基倒置于28℃恒温培养箱中,培养115PHB膜降解速率的测定2PHB膜的制备:将PHB粉末在180m(50kg/cm)1℃min后转移到冷压机上(室温),011mm的PHB膜。[10]PHB膜的降解:将已称重的,接入菌种后置于28℃摇床培养(100r/min),定时取样。,用蒸馏水冲洗干净,干燥后用分析天平称重量变化。116分生孢子悬液的制备将活化菌种的分生孢子用无菌水洗入装有玻璃珠的三角瓶中,28℃振荡10～206～7min,显微镜镜检,孢子分散,孢子浓度为10个/mL。117紫外线诱变及突变株的筛选灭菌平皿中装入5mL分生孢子悬液,在磁力搅拌器下用紫外灯(30W,照射距离[11]15cm～20cm)照射,时间为20～80s,处理后的悬液在无菌室红灯下适当稀释。初筛:取上述菌悬液012mL涂布于培养基上,避光培养2～3d,计数存活菌落,计算存活率。选取单菌落,点植法培养,观察并定期测量菌落周围水解透明...