番茄内生产酸菌的分离与初步鉴定张全钢*张利平(河北人学生命科学学院，河北保定071002)摘要：植物内牛:菌广泛存在于各种植物中，在与宿主的协同进化过程中形成了两者的互惠共生关系。木研究从番茄样品屮分离到内牛产酸菌1株，编号：S11-K经过形态观察及16SrDNA基因序列系统发育分析结果表明：菌株S11-1应归属于假单胞菌属｛Pseudomonas)o关键词：内生菌；产酸菌；分离；鉴定：Q815文献标识码：AIsolationandIdentificationofAcidogenicbacteriaEndophytesfromTomatoZhangQuangang,ZhangLiping,(HebeiUniversityofLifeSciences,Baoding,071002)Abstract:Plant,endophytesarefoundwidelyinallkindsofplantsstudied,therearecollaborationwiththeevolutionaryprocessandmutualsymbioticrelationshipbetweenplantsandendophytes・Inthisstudy,1AcidogenicbacteriaEndophytewasobtainedfromTomato.Accordingtotheresultsofmorphologicandpolyphasictaxonomy,thestrainSI1-1belongstoPseudomonas・Keywords:Endophyte；acidogenicbacteria;isolation;identification内生菌(endophyte)指其在生活史的某一阶段或全部生活在宿主组织中，不引起宿主植物明显的病害症状，与宿主建立互惠共生关系的一类微生物⑴。研究发现内生菌能促进宿主生长，提高宿主抗逆性，增强宿主竞争力，其屮内生产酸菌可用于新的活性物质的筛选。近年来，在医学、农业和生物学屮对内生菌的研究和应用逐渐成为新的热点，并取得了许多进展纱役1材料与方法1.1材料新鲜的番茄。1.2培养基分离培养基(%)：葡萄糖1、尿素0.1、KH2P040.1>MgS04•7H200.1.蛋白豚1、牛肉膏0.3、酵母膏0.3、CaC030.7、琼脂2,pH67.0。斜面培养基(%):葡萄糖1、蛋白月东1、KH2PO40.1、MgSO,・7出00.2、酵母膏0.5,酶解酪素0.3,琼脂2,pH6.7-7.0o液体培养基(％):葡萄糖1、牛肉膏0.3、蛋白腺1、K2HP040.1.MgS04・7氏00.2、酵母膏0.5,pH7.0c1.3分菌方法1.3.1供试样品的表面消毒和检验：川洗涤液洗净样品表面，流水冲净残留的洗涤液。再用70%乙醇浸泡加in,后用0.2%升汞浸泡lOmin,磁力搅拌下无菌水清洗10遍⑷。取最后一遍清洗的无菌水0.5L涂布于分离培养基，每个处理重复3次，28°C下培养3-5d,据此验证此消毒方法是否能全部杀死供试材料表面微生物了。1.3.2帝茄内牛菌的分离和纯化：表血消毒处理后的样胡，用磷酸盐缓冲液(蒸僻水lOOOmL,NaCl8g,KCl0.2g,KH2PO40.2g,Na2HPO4l.Og,pH7.4)研僭，研磨液川四层无菌纱布过滤后取0.ImL涂布于分离培养基，•作者简介:张全钢(1980-),男(汉)，河北唐山人,河北大学硕士研究生,主要从事微生物发酵研究。电话:013931200351,E-mail：zhangqucingang036@126・com28°C下培养35d,挑取rh于产酸而使CaCO?溶解形成透明而清晰的溶钙圈的菌落转接到斜面培养基上保存L6]o1.4菌株的初步鉴定菌体接种到液体培养基中，28°C摇床培养24h,6000r/min离心5分钟收集菌体，用CTAB法工提取基因组DNA。PCR扩增16SrDNA采用通用引物，Pf为5r-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3f,Pr为5AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3zo扩增程序为：95°C预变性4min,进入循环：94°C变性40s,55°C退火40s,72°C延伸l.Smin,进行30个循环后,72°C后延伸10minoPCR扩增产物经电泳检测后送北京三博远志牛物有限责任公司测序。将所测得16SrDNA序列在GenBank屮通过BLAST进行比较，从GenBank屮获得和试验菌株相近种属的16SrDNA序列构建系统发育树，以确定供试菌株的分类地位。采川Clustalw1.8软件进行多序列匹配排列，进化树的构建用PHYLIP软件包中的Neighbor-joining进行，进化距离根据PHYLIP软件包中的Kimura2参数模型來计算【叫2结果2.1番茄内生菌的分离结果番茄表而消毒检验屮未出现菌落，表明该消毒法可行，分离的是番茄内共生微生物。从番茄样品分离到能产生溶钙圈的产酸菌1株，编号Sll-lo2.2菌株S11-1的初步鉴定2.2.1形态特征：菌落圆形白色，不透明，表面凸起有光泽，边缘整齐规则。菌落潮湿，挑起呈丝状。培养3天后为红色。菌体是直或微弯的短杆菌。好氧，革兰氏染色阴性。2.2.2菌株16SrDNA系统发育结果：菌株S11-1的16SrDNA核酸序列长为1453bp,将其与从GenBank等数据库中调出的相应菌...