siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响作者：李大可,彭芝兰,周斌兵【摘要】目的:观察HPV16E6siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响。方法：利用脂质体将HPV16E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞，通过荧光定量RTPCR检测E6mRNA的变化，流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化，MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化。结果：HPV16E6siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6mRNA和E6蛋白的表达，抑制率分别为89.5％和98.1％；表达载体可明显增加细胞凋亡率，抑制细胞的增殖和克隆的形成。结论：HPV16E6siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，增加细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成。【关键词】siRNA表达载体；宫颈癌；细胞增殖；凋亡研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因在宫颈癌的发生发展及恶性表型的维持中起着至关重要的作用，因此它已成为宫颈癌基因治疗的理想靶点之一。RNA干扰(RNAi)技术是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法［12］。已有研究证实，化学合成的小干扰RNA(siRNA)能有效地抑制目的基因的表达，但作用持续时间短，而siRNA表达载体的方法可能延长作用持续时间［3］。本研究拟通过载体介导的RNAi技术来封闭宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，观察HPV16E6siRNA表达载体对Caski细胞增殖的影响。1材料和方法1.1细胞转染Caski细胞为HPV16阳性的宫颈癌细胞株，购自武汉大学典型物培养保藏中心。在研究中用脂质体法将HPV16E6特异性siRNA表达载体E62(由第一作者所在实验室设计构建保存)［4］和空载体P0转染Caski细胞，通过G418(1500μg·ml-1)抗性筛选，至空白对照细胞完全死亡后，降低G418为750μg·ml-1，转染后14d得到抗性克隆细胞，分别命名为CaskiE62、CaskiP0。收集抗性克隆形成后1周的细胞。1.2荧光定量RTPCR检测HPV16E6mRNA的表达1.2.1细胞总RNA的提取及逆转录操作参照试剂盒[TrizolTMRNAIsolationReagent(GIBCO)和RevertAidTMFirstStrandcDNAsynthesisKit(MBI)]说明书进行。1.2.2荧光定量RTPCR扩增实验设Caski组（空白对照组）、CaskiP0组（空质粒转染组）、CaskiE62组3组，每项检测重复3次，取平均值。为避---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---免收集细胞和实验过程中RNA的降解、所收集细胞数量的差异以及实验过程中操作带来的误差，计算时用细胞中表达恒定的看家基因GAPDH(3磷酸甘油醛脱氢酶)逆转录扩增产物量的CT值来校正HPV16E6mRNA表达变化。HPV16E6上游引物为5′GAATGTGTGTACTGCAAGCA3′，下游引物为5′CACAGTGGCTTTTGACAGTT3′，TAQman探针为5′CAGCATATGGATTCCCATCTC3′。GAPDH上游引物为5′TGGGTGTGAACCACGAGAA3′，下游引物为5′GGCATGGACTGTGGTCATGA3′，探针为5′CTGCACCACCAACTGCTTAGC3′。其中探针于5′端标记荧光发光基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。在荧光定量PCR仪上进行PCR，扩增条件如下:94℃1min；94℃10s，55℃30s，72℃1min，45个循环；55℃30s。从PCR动力学曲线读取荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数CT值。1.2.3荧光定量RTPCR结果计算参照文献［5］报道的比较阈值法。从各样品荧光定量PCR动力学曲线中判读其Ct值，用处理组样本基因的Ct值减去处理组参照基因的Ct值，得到ΔCt1，同样，用对照组样本基因的Ct值减去对照组参照基因的Ct值，得到ΔCt2，再用ΔCt1减去ΔCt2，得到ΔΔCt，即ΔΔCt＝ΔCt1-ΔCt2。处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式：处理组样本基因/对照组样本基因=EX-ΔΔCt。抑制率=（1-EX-ΔΔCt）×100％。1.3流式细胞仪检测HPV16E6蛋白的表达流式细胞仪由四川大学人类疾病生物治疗实验室提供。流式细胞术检测阴性对照组、Caski组、CaskiP0组、CaskiE62组4组细胞中HPV16E6蛋白的表达，每项检测重复3次，取平均值。蛋白抑制率公式：［1-（转染后待测样品的蛋白荧光强度-阴性对照）/（未转染样品的蛋白荧光强度-阴性对照）］×100％。1.4细胞凋亡测定胰酶消化培养好的细胞，得到细胞沉淀，置于1mle...