第33卷第6期2006年北京化工大学学报Vol.33,No.6JOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGY2006巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶陈晶晶陈劲春3(北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029)摘要:对巴斯德毕赤酵母GS115菌株在工业培养基中发酵和分离条件进行了研究。结果表明:将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至35g/L和5g/L时,酵母生长期的细胞密度与传统培养基的相差不大,但培养时间可减少4h,节省了生产成本;维持诱导期间的pH值为410对目标蛋白的表达最有利,目标蛋白的表达量占酵母分泌蛋白总量的70%,比原来增加了近30%;分离纯化过程,采用将强阳离子(SPFF)与弱阴离子(DEAE)交换层析柱偶联的分离方法,达到除杂,并浓缩目标蛋白的作用,目标蛋白产量约为50mg/L;将目标蛋白酶切后,质量酶活性为8156×10-3mol/(s·g)。在临床上应用的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶,蛋清溶菌酶是一种异源蛋白,在人体内可能会产生免疫原性和副作用。人溶菌酶(HLZ)是人体内的一种蛋白质,和人体具有天然相容性,临床上应用时,比其他溶菌酶更安全,没有刺激性和副作用1。此外,溶菌酶作为食品防腐剂和婴儿食品添加剂,已在食品工业上得到广泛应用2。HLZ的溶菌活性比蛋清溶菌酶高出3倍,且热稳定性也高于蛋清溶菌酶的热稳定性3。国内利用毕赤酵母发酵生产HLZ的研究还比较少,有利用大肠杆菌和真菌表达系统的报道,表达最高水平为40mg/L4。国外有采用毕赤酵母发酵生产蛋清溶菌酶的报道5,但没有对HLZ的表达进行进一步研究。本文针对传统工业培养基中碳源、氮源的质量浓度和诱导期间的pH值对重组HLZ表达量的影响进行了研究,提高了重组HLZ的产量,为今后实现重组人溶菌酶的工业化生产提供了参考依据。GS115,为本实验室保存。11112培养基酵母培养基YPG(质量分数):1%酵母提取物,2%大豆蛋白胨,1%甘油。工业培养基(g/L):二水硫酸钙0193,硫酸钾1812,七水硫酸镁1419,甘油35,硫酸铵5,柠檬酸三钠1147,011mol/L的pH值610磷酸钾缓冲液。微量元素(PTM)(g/L):五水硫酸铜610,碘化钾018,一水硫酸锰310,二水钼酸钠012,硼酸012,氯化钴015,氯化锌2010,七水硫酸亚铁6510,生物素012,浓硫酸11113其他材料SPFF强阳/DEAE弱阴离子交换层析柱和填料均购自AmershamBiosciences公司。中空纤维膜购自天津膜公司,酵母型重组肠激酶购自罗氏公司,10k透析袋购自北京泽平科技有限公司。112方法11211培养方法将保存的菌种接到YPG培养基中,28℃和200r/min的条件下振荡培养12h,然后以5%的接种量转接到工业培养基中,在28℃和200r/min的条件下振荡培养。期间,用氨水调节培养基的pH值使之保持在515,待甘油耗尽后,饥饿1～2h开始诱导。诱导期调节pH维持在410,每12h补加体积分数015%的甲醇诱导,诱导84h后停1材料与方法111材料11111菌种含人溶菌酶基因的PichiaPastoris收稿日期:2005212215第一作者:女,1981年生,硕士生3通讯联系人E2mail:jingchunchen@hotmail.com积即得细胞质量浓度;甘油浓度用高碘酸钠氧化法测定6;发酵液中总蛋白浓度测定参考考马斯亮蓝染色法7;发酵液中目标蛋白(重组人溶菌酶原)浓度的测定法是取发酵液离心后的上清走SDS2PAGE,将凝胶进行计算机扫描分析,用BIO2PRINT凝胶成像与分析系统分析目标蛋白的含量,根据考马斯亮蓝染色法测定的发酵液中总蛋白的量推算出目标蛋白浓度8。11213分离方法将发酵液离心,收集上清液,用6k～30k的中空纤维膜截留。让收集的蛋白溶液先流过SPFF强阳离子交换层析柱,洗脱收集的蛋白液再流过DEAE弱阴离子交换层析柱,收集洗脱峰。强阳离子交换步骤,采用磷酸缓冲体系,pH值为710;弱阴离子交换步骤,采用Tris2HCl缓冲体系,pH值为810。最后将经两步离子交换层析柱得到的蛋白液用10k透析袋除盐12h,收集备用。故将工业培养基中甘油质量浓度降低至35g/L。表2(NH4)2SO4质量浓度对细胞吸光度A600的影响Table2Effectof(NHSOconcentrationoncellabsorbencyA6004)24ρ((NHSO/g/L4)24)()A60045739.849.8840.71043.3由表2可见,当(NH4)2SO4质量浓度为5g/L时,菌体吸光度较大,且相关的实验表明,适当的减少氮源添加量可以减少酵母对杂蛋白的分泌量。故将工业培养基中(NH4)2SO4质量浓度降低至5g/L。21112诱导期间pH值的优化诱导期...