serp1对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡的保护作用

serpl对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡的保护作用[摘要]目的探讨内质网应激相关蛋白1(serpl)对体外过氧化氢诱导大鼠血管内皮细胞凋亡的保护作用。方法体外培养的大鼠血管内皮细胞均匀种于6孔板内,分为空质粒组、空质粒+过氧化氢组、serpl质粒组、serpl质粒+过氧化氢组。根据不同的实验目的各组加入不同浓度的过氧化氢。用PI/hochest焚光染色法对400Pmol/L过氧化氢组进行细胞凋亡的检测;米用细胞划痕实验检测100umol/L过氧化氢组进行伤口修复情况;采用Westernblot法观察serpl过表达对GLP-1R表达的影响。结果serpl质粒+过氧化氢组内皮细胞凋亡率明显低于空质粒+过氧化氢组,而修复率却明显高于转染空质粒过氧化氢组,差异均有统计学意义(P[关键词]内)贞网应激相关蛋白1;GLP-1党体;血管内皮细胞[中图分类号]R363[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2016)10(a)-0013-04ProtectiveeffectofserplonendothelialcellsinducedbyhydrogenperoxideFENGLishuaiWANGQianqianMAXuWEILiWANGJianboTheSixthPeople’sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200023,China[Abstract]ObjectiveToinvestigateendoplasmicreticulumstressassociatedprotein1(serpl)’sprotectiveeffectontheapoptosisofvascularendothelialcellsinducedbyhydrogenperoxide.MethodsRatvascularendothelialcellswereplantedin6-wellplatesandthendividedintotheemptyplasmidtransfectiongroup,emptyplasmid+hydrogenperoxidegroup,serplplasmidgroup,serplplasmid+hydrogenperoxidegroup,differentconcentrationsofH2O2wereaddedaccordingtodifferentexperimentalobjective.FluorescencePl/hocheststainwereusedtodetectthecellapoptosisamonggrouptreatedwith400umol/Lhydrogenperoxide;andcellscratchtestwereusedtoobservewoundrepairingamonggrouptreatedwith100umol/Lhydrogenperoxide;theGLP-1receptorexpressionweremeasuredbyWesternblot.ResultsComparedwithemptyplasmid+hydrogenperoxidegroup,endothelialcellsapoptosisratewassignificantlyloweramongtheserplplasmid+hydrogenperoxidegroup,therepairingratewassignificantlyhigher,thedifferencewasstatisticallysignificant(P1对象与方法1.1对象大鼠血管内皮细胞(RAOEC,ATCC);DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);PCMV6-SERPUGFP质粒、PCMV6-empty质粒(美国oriGENE公司);荧光倒置显微镜(德国Zeiss公司)、一抗GLP-1R(美国Novus公司)、一抗serpl(美国Abeam公司)、一抗3-actin(美国CellSignaling公司);Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司);Opti-MEM(美国GIBCO公司);BCA蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)。1.2内皮细胞转染及药物处理将处于最佳生长期的内皮细胞接种于6孔板中,用未添加抗生素的含10%FBS高糖DMEM培养基于37°C>5%CO2孵箱中培养。在6孔板上标记空质粒组;空质粒+过氧化氢组;serpl质粒组、serpl质粒+过氧化氢组,以便后续转染及药物处理等实验操作。待细胞达到80%左右,开始转染。先在Nanodrop2000分光光度仪上测定PCMV6-SERPl-tGFP质粒和PCMV6-empty质粒的浓度,配制每孔所需的转染试剂量;于一个EP管内加入250uLOpti-MEM后再加入2ugPCMV6-empty或PCMV6-SERPl-tGFP质粒,混匀,室温静置5min;另一EP管内加入250uLOpti-MEM后再加入5PLLipofectamine2000;两EP管1:1混匀,室温孵育30min,在孵育期间,将待转染的6孔板换液后,将混合液按6孔板上的标记分别相应待转染的孔板内。转染4h后吸掉原培养液,换新鲜的完全培养基,放于5%CO2培养箱中继续培养。转染时间达24h后,按6孔板上事先做好的标记分别加入400Pmol/L或100Pmol/L的过氧化氢。24h后将不同浓度过氧化氢处理的血管内皮细胞分别用PI/Hochest双染色法和细胞划痕实验检测其凋亡和增殖情况。每次实验至少重复3次。1.3细胞凋亡检测PI/Hochest双染色是用来检测细胞凋亡的一种方法,PI将晚期凋亡的细胞染色成红色,Hochest将正常细胞核染成均匀蓝色。本研宄将荧光显微镜下红光与蓝光个数的比值记为内皮细胞的凋亡率进...

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