肺炎支原体及耐药多重RT-PCR检测试剂的研宄耿红(浙江省医疗器械研究所310009)【摘要】目的：开发一次试验即可明确是否有肺炎支原体感染及所感染的肺炎支原体是否耐药的检测试剂。材料与方法：木试剂盒以PAGE纯化的引物、HPLC纯化的Taqman水解探针以及基因工程表达的热启动Taq酶作为主要扩增体系组分。结果：初步的临床实验结果证明，该试剂组分对痰液样木内肺炎支原体的检测灵敏度是94.93%,特异度是97.17%。结论：该试剂相关性能达到了国内临床诊断试剂所要求的主要性能指标。【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2013)27-0158-03肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)是一种常见的呼吸道病原体，通常导致轻微的上呼吸道感染，如喉咙痛、咽喉炎和气管炎［1］,其引起的肺炎占非细菌性肺炎的50%,还可引起肺外并发症，累及一个或多个系统、器官，如皮肤、胃肠道、心血管、骨骼肌肉和肾脏，严重时可致中枢和外周神经系统病变，甚至死亡。其潜伏期较长(2-3周)，而且传播率较低，导致流行期可持续1年左右，继而维持数年低发病率，3-7年后再出现流行高峰［2-3】。其主要通过飞沫以气溶胶形式传播，存留在鼻、喉、气管和痰液中，密切接触可能引起肺炎支原体的暴发［4］。肺炎支原体无细胞壁，因此，对影响细胞壁合成的抗生素如青霉素等不敏感，但是，对影响细菌蛋白合成的抗生素如大环内酯类、喹诺酮类等敏感［5］。因此，大环内酯类是治疗肺炎支原体感染的首选药物，它可结合于肺炎支原体核糖体50S亚基的转肽酶中心与肽输出通道之间的部分，通过机械阻塞通道而抑制肽链的延伸，从而达到抑制蛋白合成的目的，其结合位点由23SrRNA结构域V的核苷酸构成，其中2063和2064位点是主要的组成部分［6-7］。近年来，随着大环内酯类抗生素的广泛使用，临床分离出了耐药菌株，提示肺炎支原体耐药现象的存在［8-9］。国内外的研究表明，产生耐药的肺炎支原体在23SrRNA序列上发生点突变，其中，最常见的是2063位点A到G的突变，2064位点A到G的突变［10］。目前，临床上对肺炎支原体耐药性的检查，主要是依靠肺炎支原体的分离及药敏实验，由于肺炎支原体分离较为闲难，所以灵敏度较低，而且耗吋耗力，不利于及吋指导用药［11］。本研究拟采用的荧光PCR技术，操作简便、检测迅速、检出率高，通过一次试验即可明确是否冇肺炎支原体感染及所感染的肺炎支原体是否耐药，奋利于对疾病进行及时诊断及合理选择治疗方案，与传统分离培养检测技术相比，提高了检出效率、降低了漏检率，有利于对疾病进行及吋诊断及合理选择治疗方案，可对多种临床样本进行高效可靠的筛查，以及对临床病情和用药效果进行监测，指导合理用药。1材料与方法1.1材料1.1.1临床样本：病人的痰液样本。1.1.2引物和探针:根据肺炎支原体标准株的P1基因与23SrRNA序列，从NCBI数据库下载0的基因片段序列，利用AlleleID软件设计多重扩增体系采用的引物探针，上海生工公司合成，.其序列为：(1)肺炎支原体(Mp)优选的引物和探针分别为：上游引物MpF:GGAATCCCAATGCACAAGAACAMpF:TGTCTCTTCAAGGGATTCACCT下游引物MpR:GCTTTGGTCAACACATCAACCTTMpR:TCTTGTTGCAATGATGAGGGTG探针MpP:5’FAM-CCTTGAAGGCTGGGTTTGCGCTA-BHQl3’MpP:5’FAM-TGTCACTGCGGTTGTTGTGCCTACATCT-BHQ13’(2)肺炎支原体2063(MpPl)和2064(MpP2)位耐药位点检测用引物探针:上游弓I物MutF:GTGAAGACACCCGTTAGGC下游引物MutR:ATTAGAACAGCACACAACCAAG探针MpPl:5’ROX-ACGGGAAGACCCCG-MGB3’探针MpP2:5’ROX-ACGGAGAGACCCCG-MGB3’1.1.3试剂：TaqDNA聚合酶、UNG酶、MgCI2、dUTP、DMSO,总RNA提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司。1.2方法1.2.1总RNA的提取采用西安天隆科技的核酸提取试剂盒（磁珠法）进行抽提。1.2.2RT-PCR反应在25μl体系里进行一步法核酸扩增反应，反应溶液组成是：10×Buffer,2.5mMdNTPmix,DMSO,20μM探针和20μM引物，5U/μLHotStartTaq酶，UNG酶，最后，50°C,1个循环；95°Clmin,1个循环；91°C,15s,64°Clmin,40个循环，在64°C收集荧光。本试剂盒需要采用FAM、VIC和CY53种荧光进行实验，其中，CY5...