微生物转化虎杖苷粗提物生成白藜芦醇的研究作者：袁润蕾，徐萌萌，孙艳娟，李猷，孙启玲，万端极【摘要】目的利用一株根霉菌对虎杖苷粗提物进行液态发酵，使虎杖苷转化成白藜芦醇。方法采用单因素实验确定氮源种类及添加量，通过正交实验法优化发酵条件。结果在10%虎杖苷粗提物中添加1.5%的尿素作为氮源，采用薄层色谱法（TLC）确定在优化发酵条件下转化时间为26.8h，通过高效液相色谱法HPLC证明虎杖苷转化为白藜芦醇，转化率95.8%。结论虎杖苷粗提物可以通过微生物发酵得到白藜芦醇。【关键词】虎杖苷；白藜芦醇；根霉菌；微生物转化Abstract:ObjectivePolydatininPolydatinextractionwastransformedtoresveratrolinliquidstatefermentationbyR.nigricans.MethodsThekindandtheappendmateofnitrogensourcewereconfirmedbythesinglefactorexperiment.Theconditionsoffermentationwereoptimizedbyorthogonalexperiment.ResultsCarbamidewastheoptimumnitrogensourceandtheappendmatewas1.5%.Undertheoptimizedconditionthetransformationtimewas26.8h.ItwasproovedthatPolydatincouldbetransformedtoResvertrolbyhighperformanceliquidchromatographyandthetransformationratecouldreach95.8%.ConclusionPolydatininPolydatinextractioncanbetransformedtoresveratrolbymicrobialtransformation.Keywords:Polydatin；Resveratrol；R.nigricans;Microbialtrasformation虎杖为蓼科植物PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.的干燥根茎，别名苦杖根、活血龙、大虫杖等［1］。其中重要的活性成分为二苯乙烯类的白藜芦醇（Resveratrol）和白藜芦醇苷(Polydatin)，也叫虎杖苷。白藜芦醇是一种活性多酚类物质［2］，具有明显的降低血脂，预防心脑血管疾病以及抗癌等重要作用，是目前世界上一种最新的药用保健活性物质，有望发展成为抗癌新药［3］。目前，该产品国际市场需求量大，具有良好的市场前景。天然白藜芦醇主要以葡萄糖苷（虎杖苷）的形式存在于虎杖中，虎杖中的白藜芦醇含量在0.1%～0.2%左右，虎杖苷的含量在2%左右，虎杖苷的含量明显高于白藜芦醇。理论上，采取化学法能将虎杖苷转化为白藜芦醇，但其工序繁杂并生成大量的异构体，造成分离纯化困难，生产成本非常高，不被认可。目前，生物法是直接利用虎杖进行带渣发酵，通过根霉菌分泌的酶切断白藜芦醇苷的糖苷键，转化得到白藜芦醇（图1），该法存在发酵体积庞大、成本高、发酵浓度无法提高等问题［4］。因此本课题利用虎杖苷粗提物进行发酵，可以提高发酵体系中虎杖苷的含量、缩小发酵体积、提高发酵效率，更易于白藜芦醇这种医药中间体的工业化，为生产白藜芦醇提供了一种便捷、有效的方法。1器材与方法1.1仪器与药品DOINEX高效液相色谱仪；AN0298分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；虎杖（湖北省药材公司）；虎杖苷标准品、白藜芦醇标准品（成都思科华有限责任公司）；其它试剂均为分析纯；无机盐浓缩液：KH2PO40.1%,MgSO40.05%,(NH4)2SO40.1%；虎杖苷粗提物（粉末状，虎杖苷含量14.78%）。1.2菌种编号T-34，由四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室提供，从自然界分离筛选得到，经鉴定为一株根霉菌。1.3方法1.3.1虎杖苷和白藜芦醇的TLC检测方法虎杖苷和白藜芦醇的TLC法薄层色谱［5］条件，展开剂：醋酸乙酯-丙酮-醋酸体积比为6∶2∶0.5；显色剂：3%磷钼酸无水乙醇溶液,110℃显色3min［5］。1.3.2虎杖苷和白藜芦醇的高效液相色谱法HPLC检测方法色谱柱C18柱（4.6mm×150mm）,柱温25℃,流动相甲醇-水为40∶60；流速1ml/min,进样量20μl,检测波长305nm。根据标准样的峰面积和进样浓度作回归曲线，白藜芦醇的回归方程为Y=1.40×108X+1.21×104,相关系数r=0.999913，在20～100μg/ml范围内和峰面积成线性关系；虎杖苷的回归方程为Y=9.61×107X-1.84×105，相关系数为r＝0.99982，在20～100μg/ml范围内和峰面积成线性关系。1.3.3氮源的选择以10%虎杖苷粗提物添加1%无机盐浓缩液作为发酵培养基，分别在培养基中添加1%的硝酸铵、氯化铵、大豆粉、酵母膏、硫酸铵、尿素等氮源，180r/min，30℃培养，通过检测虎杖苷的完全转...