>z<>z<大鼠肝星状细胞分离及培养方法实验探究［摘要］目的:探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法，为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件。方法:采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化，经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心(20000r/min)和细胞悬液低速离心(40g)去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度。结果:肝星状细胞的得率为(3.6±0.1)x107/flT,肝星状细胞存活率为(92.8±0・8)%,对培养24h的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为(96.2±0.5)%。结论:本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究。［关键词］肝星状细胞;细胞分离;原代培养;细胞鉴定［中图分类号］R329.2+8［文献标识码］A［文章编^]1673-7210(2010)05(b)-030-03TheexperimentalstudyofrathepaticstellatecellsseparationandcultivationSHIHuiminl,XUJunquan2,WANGDengni2,WANGMingliang2,SONGBinyu2(1.ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2.ShanxiMedicalUniversityFenyangCollage,Fenyang032200,China)[Abstract]Objective:Toexploreaneconomicalandeasymethodforisolatingandculturingtherathepaticstellatecellstostudythepathogenesisofhepaticfibrosis.Methods:Adulthealthyrats,isolatedliverswereperfusedbycyclophoraseliquidinvitro・Afterthedensitygradientcentrifugationofnycodenzeatthespeedof20000r/minandthelow-speedcentrifugation(40xg)ofcellsuspension,thehigherpurityhepaticstellatecellswereobtained.Therefusalrateofcellscouldidentifytherateoflivecellsinthetrypanbluetest;desminandGFAPimmunocytochemistry(doubleantibodiesandsinglestaining)wereusedtoidentifythepurityofhepaticstellatecells・Results:Theyieldofhepaticstellatecellswas(3.6±0.1)x107perliver,thesurvivalrateofhepaticstellatecellswas(92.8±0.8)%,HSCsculturedfor24hourswereidentifiedbydesminandGFAP,singlestainingtherateofpositivecellwas(96.2±0.5)%.Conclusion:Theimprovedmethodincreasesthepurityoftheprimaryrathepaticstellatecellsonthebaseofpromisingtheyieldinordertostudytheprimary>z<hepaticstellatecellsandliverfibrosis.[Keyword]Hepaticsatellitecells;Cellisolation;Primaryculture;Cellidentification肝星状细胞(hepaticsatellitecells,HSCs)是肝脏内的一种非实质细胞，占整个肝脏的8%~13%[1-2]o研究表明，此细胞活化后在形态上将转化为肌成纤维样细胞,在功能上将分泌大量的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)[3-5],导致肝纤维化。一般认为,原代的HSCs适合研究静止的HSCs的生物学行为,而传代培养适合研究活化的HSCs的生物学行为[6]。在健康动物体内,HSCs绝大部分以未活化的形式存在,那么HSCs的活化过程将成为肝纤维化发病机制研究的中心环节。早在1982年,Knook等[7]采用两种不同密度梯度离心的方法分离得到HSCs,上面一层为未活化的HSCs,下面一层从上到下分别为活化的HSCs、Kupffer细胞和E细胞[8],这样不仅使活化和未活化这两种状态的细胞位于不同的液面层,而且也去除了HSCs里面的Kupffe「细胞，这样分离得到成年大鼠原代未活化的HSCs,大大提高了HSCs的纯度，为HSCs的特性研究以及阐明肝纤维化的发病机制提供了条件。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物Wistar雄性成年大鼠15只（购于山西医科大学实验动物©Nycodenze中心），体重（300±23）g,普通饲料喂养，自由进食。1.1.2主要试剂链酶蛋白酶（Rochel14-9643）,IV型胶原酶（SigmaC5138）,l型DNA酶（索莱宝公司）,Nycodenze粉末（Axis-ShieldPoC,Oslo,Norway）,DMEM培养基干粉（Invitrogen公司），胎牛血清（优级）（杭州四季青），结蛋白（desmin）抗体（博士德BM0036）,胶质纤维酸性蛋白（glialfirillaryacidicprotein,GFAP）抗体（博士德BA0056）等。1.1.3主要仪器设备蠕动泵,C02培养箱（法国JouanlGO150）,生物倒置显微镜,...