临床检验诊断学专业优秀论文HPV16E7特异性siRNA对HaCaT细胞HLA-Ⅰ类分子表达的影响关键词：人乳头瘤病毒16型E7基因RNA干扰HLA-Ⅰ类抗原HaCaT细胞分子表达宫颈癌基因治疗摘要：目的:合成并筛选针对HPV16E7基因有效的siRNA，探讨其对HaCaT—E7细胞中HPV16E7mRNA、TAP1及细胞表面HLA—Ⅰ类分子表达的影响。方法:1．siRNA的合成和筛选化学法合成3条HPV16E7特异性siRNA，应用转染试剂Lipofectamine2000将其转染入HaCaT—E7细胞，24h后收集细胞，TRIZOL法提取细胞总RNA，以OligodT为引物将RNA逆转录为cDNA，以管家基因β—actin为内参照，实时荧光定量PCR检测HPV16E7mRNA的表达水平，分析各个siRNA的作用效果，筛选出抑制效果最好的siRNA。2．siRNA转染对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT—E7细胞、HaCaT—pCMV细胞应用转染试剂Lipofectamine2000分别转染siRNA2，同时设立非特异性siRNA对照和空转染对照。转染4h后更换完全培养基，于37℃，5％CO2条件培养细胞，用于不同时间点的检测。3．流式细胞术检测细胞膜表面HLA—Ⅰ类分子的表达正常HaCaT细胞、HaCaT—E7细胞、HaCaT—pCMV细胞转染siRNA24h、48h、72h后，收集细胞，检测其细胞表面HLA—Ⅰ类分子的表达。0．25％胰酶消化后，用含1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS（PBS—B）重悬，加入20μL抗HLA—ABC—FITC或抗KLH—FITC（同型对照），混匀后避光静置20min，2mLPBS—B冲洗，400μLPBS—B重悬，流式细胞仪检测。4．流式细胞术检测细胞内部抗原处理相关转运蛋白TAP1的表达正常HaCaT细胞、HaCaT—E7细胞转染siRNA72h后，0．25％胰酶消化，Fixation/Permeabilization破膜处理，PBS—B重悬，20μL鼠抗人TAP1单克隆抗体作用30min，Perm/Washbuffer冲洗，1：100稀释的羊抗鼠IgG—FITC抗体重悬，暗室涡旋混匀30min，Perm/Washbuffer冲洗两遍，400μLPBS—B重悬，上机检测。以荧光二抗为同型对照。结果:1．RT—PCR反应结束得到循环阈值（Ct值），用相对定量的方法（2—△△CT）来分析各组细胞转染siRNA后HPV16E7mRNA的表达。与空转染对照相比，siRNA1、siRNA2和siRNA3均能有效抑制HPV16E7mRNA的表达，但其抑制效果不同，其中以siRNA2作用效果最明显，抑制率达75％。2．细胞膜表面HLA—Ⅰ类分子表达的检测：正常HaCaT细胞、HaCaT—pCMV细胞、HaCaT—E7细胞分别转染siRNA2、非特异性siRNA24h、48h、72h后，流式细胞术检测各组细胞表面HLA—Ⅰ类分子的表达。HaCaT—E7细胞转染siRNA2后，细胞表面HLA—Ⅰ类分子表达水平随时间延长逐渐升高，72h的表达高于空转染对照组30％，差异具有统计学意义（P<0．01）。此外，HaCaT—E7细胞转染siRNA272h后，细胞表面HLA—Ⅰ类分子表达水平与正常HaCaT细胞相比，差异无统计学意义（P>0．05）。而正常HaCaT细胞和HaCaT—pCMV细胞在转染siRNA前后，细胞表面HLA—Ⅰ类分子的表达差异均无统计学意义（F=0．01，F=0．03，P>0．05）。3．细胞内部TAP1表达水平的检测：HaCaT—E7细胞转染siRNA2、非特异性siRNA72h后，流式细胞术检测细胞内部TAP1的表达，同时测定正常HaCaT细胞内部TAP1的水平作为对照。结果显示，HaCaT—E7细胞转染siRNA2后，TAP1表达水平升高，与空转染对照组和非特异siRNA组相比，均有统计学意义（P<0．01），与正常HaCaT细胞组相比，差异无统计学意义（P>0．05）。结论:1．化学合成---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---的HPV16E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT—E7细胞中E7mRNA的表达，不同序列siRNA的抑制效果不同。2．siRNA抑制HaCaT—E7细胞中E7mRNA表达后，可使HaCaT—E7细胞表面HLA—Ⅰ类分子的表达随时间上调，72h时达正常HaCaT细胞水平，预示着siRNA干扰技术可增加CTL对HPV感染细胞的清除机会，增强细胞的免疫原性。3．siRNA抑制HPV16E7mRNA表达后，HaCaT—E7细胞内部TAP1表达水平升高，72h时达正常．HaCaT细胞水平。靶向人乳头瘤病毒HPV16E7的siRNA干扰技术为宫颈癌的基因治疗提供了新的方案。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---正文内容目的:合成并筛选针对HPV16E7基因有效的siRNA，探讨其对HaCaT—E7细胞中H...