基于PCR勺cDNA®因克隆技术研究进展蔡欣1陈宏2,3汪虹英4(1.西北农林科技大学生命科学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌712100;2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌712100;3.徐州师范大学生物技术研究所，徐州221116;4.甘肃省漳县一中，甘肃漳县748300)摘要RT-PCR、single-sided(anchored)PCR、RACE以及stepoutRACE、DDRT-PCR、cDNARDA、SSH等都是建立在PCR基础之上的cDNA分子克隆技术，本文介绍各种技术的优缺点、应用以及与同类技术进行比较，这些技术现在已经成功应用于大量EST的分离、cDNA文库的构建、编码产物未知的差别表达基因的分离以及全长cDNA基因序列的克隆等方面。关键词cDNA基因克隆；PCR;特点；应用中图分类号：Q7ResearchProgressonPCR-basedTechniquesofcDNAGeneCloningCAIXin1CHENHong2,3WANGHong-ying4(1CollegeofLifeScience,NorthwestSci-techUniversityofAgricultureandForestry,ShaanxiKeyLaboratoryofAgricultureMolecularBiology,Yangling,Shaanxi712100China;2CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestSci-techUniversityofAgricultureandForestry,ShaanxiKeyLaboratoryofAgricultureMolecularBiology,Yangling,Shaanxi712100,China;3.InstituteofBiotechnology,XuzhouNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221116,China;4theFirstMiddleSchoolofZhangxianCounty,Zhangxian,Gansu748300,China)Abstract:RT-PCR,single-sided(anchored)PCR,RACE,stepoutRACE,DDRT-PCR,cDNARDAandSSHareallthetechniquesofcDNAcloningbasedonPCR.Theadvantagesanddisadvantagesofeachtechniqueweredicussedandcomparedwiththoseoftheircounterparts.ThesetechniquesarenowsuccessfullyusedinthefieldsofisolationofnumerousESTs,constructionofcDNAlibraries,obtainingofdifferentiallyexpressednewgenesandcloningofcDNAinfulllength.Keywords:cDNAgenecloning;PCR;characteristics;applicationsKaryMullis等在1983年发明的PCR技术［1］现在已经成为分子生物学及其相关领域的经典实验方法，目前由PCR技术衍生出许多重要的相关技术，它们在基因克隆、基因测序、基因检测、基因改造以及突变分析等分子生物学以及其它生命科学研究中具有重要的应用价值；目前有许多cDNA基因克隆方法主要是建立于PCR及其衍生技术之上的，原有技术被不断改进、新的技术被不断发明，它们在cDNA文库的构建、EST的分离、cDNA基因克隆、新基因的分离、基因表达的检测分析等研究领域发挥着重要的作用。1RT-PCR当我们期望从某一序列已知的mRNA克隆cDNA时，就可以利用RT-PCR(reversetranscriptionPCR),即逆转录PCR方法，其原理是由mRNA通过逆转录反应产生的DNA链作为模板进行常规PCR扩增⑵。由于RT-PCR的放大作用和很高的敏感性，所以具有显著的优点：首先，该方法不需要纯化mRNA，总RNA就可以作为合成单链cDNA的模板，因而避免了纯化过程中mRNA的降解以及丢失；其次，该方法中单链cDNA合成后其3'末端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核昔酸，所以可以获得相当于mRNA5'末端的比较完整的序列，其中也包含着未知序列的cDNA群体［3］。RT-PCR还可以用于检测mRNA分子，PCR测序以及探针的制备等。［项目基金］国家863项目(2001AA243052,2003AA243051),国家自然科学基金(30471238)，中华农业科教基金(99-03-A-5)资助［作者简介］:蔡欣(1973-)，男，甘肃漳县人，博士生，专业：生物化学与分子生物学［通讯作者］:陈宏(1955-),男，陕西长安人,博士生导师，教授，研究方向：生物技术与动物分子遗传学2single-sided(anchored)PCR利用RT-PCR方法进行cDNA基因克隆时，首先需要有mRNA或cDNA的全长序列资料，以便根据其设计合适的引物，然后才能进行目的mRNA或cDNA全长序列的扩增；而在实际工作中，我们往往获得到的是mRNA或cDNA的部分序列，如欲获取其全长序列信息，可以选择采用single-sided(anchored)PCR,即单侧(锚式)PCR。基本原理是根据已知的mRNA或cDNA部分序列设计基因特异性引物(gene-specificprimer,GSP),同时利用寡聚胸腺嚅嚏核昔酸oligo(dT)作锚定引物...