实验概要本实验的目的是改良成年猪胰岛分离纯化技术，以优化胰岛制备方法。方法采用体、尾部区段猪胰腺胰管内灌注复合胶原酶震荡消化(胶原酶V加DNA酶)和改进的Dextran不连续密度梯度离心法分离纯化猪胰岛，并进行生物学活性测定和形态学观察。主要试剂胶原酶V，512kut/mg(Sigma)，DNA酶(Sigma)，胎牛血清(Gibco)，RPMI1640培养液(Gibco)，Dextran(Pharmacia)，Hanks平衡盐溶液(Gibco)。主要设备离心机，注射器，显微镜，超净工作台等。:.实验材料成年杂种猪，猪龄12mo，体质量150kg左右，猪被屠宰放血后，在相对无菌条件下迅速取出胰腺，保存于4℃Hanks液中送至实验室，热缺血时间少于10min，冷缺血时间少于90min。:.胰岛分离胰腺取回后，置于超净工作台上，快速去除胰周组织、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜。从胰头、胰体交界部横断胰腺，找到主胰管，用20G套管针插入，缝合线结扎，尾部远端亦结扎切断，每次均取约15-20g组织，注入4℃含Ca2Hanks液配制的复合胶原酶溶液(1.5g/L，内含DNA酶0.3g/L)，注入量=胰质量×2，注射速度7mL/min，3-4min内完成，置入玻璃容器内，在38.5±0.1℃水浴中震荡消化，震速100r/min，在消化过程中间断加入0.1mmol/L的NaOH，使消化液pH值尽可能维持在7.8左右，从消化20min开始每间隔4min取样一次，双硫腙染色镜检，当胰腺组织被消化裂解成细沙状，镜检见大部分结构完整的胰岛从外分泌组织中脱落出来，立即用4℃冷Hanks液(含100mL/L胎牛血清)终止消化，充分混匀后，用40目钢网过滤，收集消化后组织，4℃离心冼涤2次，去除脂肪等杂质细胞，取样镜检计数和观察消化后胰岛分离情况。胰岛纯化用Dextran配制成密度为1.037，1.054，1.070，1.096，1.11kg/L的不连续密度梯度液，依次将不连续密度梯度液各10mL加入50mL离心管中，最后将洗涤后的消化组织每0.5mL与1.037kg/L密度梯度液10mL混匀，小心移至离心管中液体上层，形成不连续密度梯度。将2-4个离心管置入低温离心机中，先800r/min离心5min，然后2500r/min离心15min，离心后在1.096-1.054kg/L之间收集纯化的胰岛，4℃离心洗涤2次。分别取样镜检计数，估计纯度和行生物学活性及组织学鉴定。胰岛计数和纯度测定分离纯化后的组织悬液用双硫腙(双硫腙10mg，无水乙醇3mL，250g/L氨水50mL)进行染色，光镜下胰岛细胞团染成腥红色或红色，外分泌组织不着色，呈圆形、椭圆形或不规则形.在显微镜下计数直径≥50mm的胰岛算出每克胰腺组织分离的胰岛当量数，纯度用内、外分泌组织量的比值来估计。胰岛生物学活性鉴定将纯化后胰岛细胞悬液放置在显微镜下，用巴氏吸管吸取胰岛放入培养板中，每10个胰岛当量(每1个胰岛当量相当于直径150mm的胰岛细胞团，IE)的成年猪胰岛(APIs)置入一个培养孔，6孔为1组，共4组.每组分别置入无糖培养基、含5.6mmoL/L葡萄糖(低糖)、16.7mmoL/L葡萄糖(高糖)、16.7mmoL/L葡萄糖加10mmoL/L茶碱(高糖茶碱)的RPMI1640培养液中，置于37℃、含50mL/LCO2的培养箱中孵育4h，收集培养液，用胰岛素放免试剂盒(中科院原子能研究所)测定胰岛素含量.胰岛组织学检查离心纯化后胰岛细胞悬液，收集胰岛组织，用无水酒精固定，石蜡包埋切片，HE染色检查胰岛组织结构完整性。?统计学处理所得数据以mean±SD表示，组间均数差异用t检验比较，P《0.05为有差异。2fg0f4c7c百家乐wwmckxcom/bjl/