扩环酶的固定化研究河北制药用酶集成应用技术创新中心，河北省石家庄市050000摘要：半合成青霉素类和头孢菌素类抗生素市场需求巨大，化学合成法生产费用高且污染环境严重，生物法中的扩环酶是合成头孢菌素的关键酶，它决定着头孢菌素的产量。通过共价结合的方式将扩环酶固定在载体的表面，考察在固定化时各个反应条件对酶活的影响规律，确定酶固定化温度为25℃，K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液浓度为1.5mol/L，反应时间为4h，每克树脂的酶液加入量为12mL时，固定在树脂上的扩环酶具有最佳催化活性。本研究为固定化酶反应的工业化生产提供了实验依据，为企业进一步降低成本、提高效益提供了参考与借鉴，具有实际应用价值。关键词：扩环酶；树脂；固定化；酶活β-内酰胺类抗生素指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，其中青霉素类和头孢菌素类应用最为广泛[1]。青霉素抗菌谱窄，且易引起过敏反应，目前已经不直接使用，多用于合成头孢菌素类抗生素[2]。头孢菌素具有高抗菌强度和稳定性的优点，广泛应用于临床上[3]。化学法合成头孢菌素类步骤繁琐，反应条件苛刻，生产过程中使用了大量有机溶剂[4]。由于化学法生产费用高而且污染环境严重，现在多采用生物催化合成法[5]。生物催化合成法是利用扩环酶催化青霉素底物扩环生成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(简称7-ADCA)，然后在7-ADCA上添加相应侧链，生产具有不同抑菌活性的头孢菌素类抗生素[6]。7-ADCA是合成头孢菌素的重要中间体，而扩环酶是生成7-ADCA的关键酶。固定化酶比游离酶性能稳定，催化性能更高[7-8]。所以，探索高效的酶固定化方法，可以提高头孢菌素的合成技术和产量，以满足国内外市场对半合成青霉素类和头孢菌素类抗生素的需求。根据酶和载体之间的相互不用，酶固定化有包埋法、吸附法、交联法、共价结合法、氨基酸置换法和生物素-亲和素亲和法等多种方法。其中的共价结合法使酶和载体之间的结合性更强，酶与载体间产生的强化学键可显著减少酶的散失,提高酶的重复利用率[9]。酶固定化后生成新的酶系统,使酶可以在催化反应中重复使用,降低了生产成本[10-11]。现在酶已经广泛应用于医药、食品、能源、水处理、纺织等许多产业领域。李源勋等以丙烯酸(AA)为单体,二乙烯基苯(DVB)为交联剂在致孔剂石油醚存在下,利用悬浮聚合法制备一系列不同物质的量比的AADVB二元聚合物,用其作为载体对青霉素酰化酶进行固定[12]。鲜海军等以酸部分水解聚丙烯腈纤维为载体,以戊二醛为交联剂,共价键结合制备了固定化胞外青霉素G酰化酶,所得的固定化酶具有活力高、稳定性好和能水解高浓度青霉素钾盐的特点[13]。本研究采用聚甲基丙烯酰胺合成的表面带有环氧基团的大孔树脂作为载体，将酶分子与载体的活性基团通过共价键连接，使扩环酶固定化。此方法制得的固定化酶具有良好的机械强度和稳定性，是目前工业化应用和实验研究中最常用的固定化方法。1材料与方法1.1仪器与试剂仪器：酸碱自动滴定仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；低温恒温反应浴，巩义市英峪高科仪器厂；电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司等。试剂：ES-103B环氧树脂，天津南开和成公司；扩环酶溶液，华北制药股份有限公司；磷酸二氢钾，天茂化工有限公司；磷酸二氢钾，天茂化工有限公司；氢氧化钠，天茂化工有限公司；青霉素G，河南华星药厂。1.2方法1.2.1酶固定化1）固定化实验称取ES-103B树脂1g，用0.5mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液（pH7.0）洗涤至电导率为500μS/cm以下，去除溶液后树脂待用。取10mL扩环酶溶液到50mL反应瓶中，加K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液到20ml刻度处，混合均匀后加入洗涤后的树脂，置于25℃的恒温反应浴中进行固定化，6h后取出固定化酶检测酶活。2）反应条件对固定化的影响在扩环酶进行固定化时，反应条件对固定化酶的酶活至关重要。分别设置水浴温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃进行温度对固定化的影响实验；分别设置K2HPO4-KH2PO4缓冲液浓度为0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L进行缓冲液对固定化的影响实验；分别设置固定化时间为1h、2h、4h、6h、8h进行反应时间对固定化的影响实验；分别设置酶液加入量为...