原代肝细胞分离培养技术现状及展望牟卉卉，胡康洪牟卉卉，中国科学院武汉病毒研究所国家病毒学重点实验室湖北省武汉市430071胡康洪，中国科学院武汉病毒研究所国家病毒学重点实验室湖北省武汉市430071;德国雷根斯堡大学分子和细胞解剖学研究所德国雷根斯堡93051作者贡献分布：牟卉卉负责资料的搜集、整理及文章的撰写；胡康洪负责课题方向的选择及文章的审校.通讯作者：胡康洪,430071,湖北省武汉市，屮国科学院武汉病毒研究所国家病毒学重点实验室.hukgh@wh.iov电话:027-87198362RecentstatusandprospectivesonisolationandculturetechniquesofprimatyhepatocytesHui-HuiMou,StateKeyLaboratoryofVirology,WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430071,China;Kang-HongHUpstateKeyLaboratoryofVirology,WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430071.China;InstituteofMolecularandCellularAnatomy,UniversityofRegensburg,Regensburg,D-93053,Germany.Correspond©neeto：Kang-HongHu,StateKeyLaboratoryofVirology,WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430071.China;InstituteofMolecularandCellularAnatomy,UniversityofRegensburg,Regensburg,D-93053,Germany.hukgh@wh.iovAbstractIsolatingandculturingprimaryhepatocytesisthekeystepforestablishmentofthecellularmodelofHBVinfectioninvitroandclinicalapplicationofbioartificialliver.Inthepastdecades,amountofexploringstudiesinisolatingandculturinghepatocyteshavebeenperformed.Thisreviewsummarizesthecorrespondingadvantagesanddisadvantagesoftheisolationandculturetechniquesofhepatocytesdevelopedsofaranddiscussestheprospectivesinthisfield.KeyWords:Primaryhepatocyte;HBV;Bioartificialliver;isolationandculturetechniquesofhepatocytes摘要原代肝细胞的分离和培养是体外HBV感染的细胞模型和临床应用生物人工肝的一个关键步骤.许多学者在肝细胞分离和培养领域作了大量探索，本文就近年来建立的各种肝细胞分离技术和培养技术的优缺点进行比较，并讨论了该领域今后的发展前景.关键词：原代肝细胞;HBV;生物人工肝；肝细胞分离培养技术0概述乙型肝炎是由乙肝病毒(hepatitisBvirus,HBV)引起的严重危害人类健康的病毒性传染疾病.要对HBV进入机制进行研究，就需要具有良好分化表型的原代肝细胞作为工具⑴.血随着生物人工肝在治疗急性肝衰竭领域的广泛应用，也需要具有较好生存能力和分化功能的原代肝细胞作为生物材料.所以，肝细胞的分离、培养技术受到了越来越多的关注.近年来，许多学者在原代肝细胞培养领域做了诸多探索，为肝细胞的分离、培养提供了大量的技术支持，现将各种方法的优缺点作一比较并对该领域的前景作概述性展望.1细胞的分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来，各实验室对分离方法进行了不断改进.在众多方法中，主要分为非灌流的方法和灌流的方法.1.1采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.1丄1机械分离法机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法已张顶刃刃⑷在分离树齣肝细胞的过程屮，首先将树齣的肝脏剪成小块，然后通过挤床、剪碎和震荡等机械手段，使肝细胞从肝组织上脱落，从血获得分离的肝细胞.1.1.2胰酶消化法胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞Z间的桥连，使肝细胞分离的一•种方法.Dulbecco刃胪〕首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞，并运用到体外细胞的研究和培养屮.刘友平刃加⑹利用该方法分离肝细胞时，取出小鼠的肝组织后用眼科剪剪碎至糊状，然后用缓冲液充分清洗并加入朕酶进行消化.待消化完全后用D-Hnnkt液清洗，最后加入含有血清的培养基终止胰酶的作用，得到消化彻底的细胞悬液.1.1.3胶原酶消化法胶原酶消化法是利用胶原酶來消化细胞间的纤维成分，使肝细胞分离的一种方法.王琳刃加⑺在利用该方法来分离新生小鼠肝细胞吋，首先将新生小鼠的肝脏剪成lmn...