经不同输注途径骨髓间充质干细胞治疗鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的【摘要】目的比较经腹腔注射与经尾静脉注射骨髓间充质干细胞治疗大鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的疗效。方法选取10只体重约80g的雄性清洁级SD大鼠用于骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养。另选取体重220～250g的成年大鼠60只作为研究对象，用于肝衰竭模型制备以及BMSCs输注治疗。将其中15只大鼠作为空白对照组，剩下的45只均给予白毒伞粗毒素灌胃制备肝衰竭模型，将造模成功的大鼠随机均分为3组，即肝衰竭模型组、经腹腔注射治疗组及经尾静脉注射治疗组。对两治疗组予BMSCs经两种途径输注治疗，对比各组大鼠7d生存率及肝功能、凝血功能、炎症因子等指标情况。结果与肝衰竭模型组相比，两治疗组SD大鼠体重减轻明显更少（P<0.05），7d生存率要明显更高[73.3%、80.0%VS20.0%]（P<0.05），两治疗组上述指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后两治疗组大鼠肝功能、凝血功能、炎症因子等指标均较肝衰竭模型组显著改善（P<0.05），两治疗组上述指标比较差异无统计学意义（P>0.05），空白对照组大鼠肝功能、凝血功能、炎症因子等指标与其他三组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论经腹腔注射和经尾静脉注射两种输注途径骨髓间充质干细胞对白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠具有十分明显的治疗作用，能显著改善大鼠肝功能衰竭，且效果相当。【关键词】骨髓间充质干细胞；白毒伞；急性肝衰竭；疗效；输注途径DOI：10.14163/jki.11-5547/r.2016.20.192白毒伞（amanitaverna）为剧毒蘑菇，近年来广东地区频频发生因误食白毒伞而中毒死亡的事件。白毒伞鹅膏毒肽主要损害肝脏，其中毒致急性肝衰竭死亡率>95%，危害极大。白毒伞中毒致急性肝衰竭（AALF）发病凶猛，临床症状复杂，治疗难度较大，至今仍是医学界的难题之一[1]。目前国内外仍然缺乏对白毒伞中毒致急性肝衰竭的有效治疗手段，而随着医学界对干细胞研究的逐渐深入，应用干细胞对急性肝衰竭的治疗已经得到了迅速的发展。本研究以此为背景，比较经腹腔注射与经尾静脉注射两种不同输注途径骨髓间充质干细胞治疗大鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的疗效，旨在为选择合理的输注途径提供参考，现报告如下。1材料与方法1.1材料选取10只体重约80g的雄性清洁级SD大鼠用于骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养。另选取体重220～250g的SD大鼠60只作为研究对象，用于模型制备以及BMSCs输注治疗。实验动物由广州医科大学动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。将其中15只大鼠作为空白对照组，另外45只均给予白毒伞粗毒素灌胃制备肝衰竭模型，将造模成功的大鼠随机分为肝衰竭模型组、经腹腔注射治疗组及经尾静脉注射治疗组，各15只。1.2仪器与试剂主要试剂包括DMEM培养基（Gibco公司）、胎牛血清（四季清公司）、胰蛋白酶（宝泰克公司）、PBS缓冲液（自制）。主要仪器包括超净工作台、恒温细胞培养箱、荧光倒置显微镜、离心机、水浴箱、低温冰箱等。1.3BMSCs的制备将所选取用于制备BMSCs的大鼠断颈处死，取其股骨，无菌条件下采集大鼠骨髓液，采用密度梯度离心法[2]，反复贴壁分离纯化BMSCs。抗凝骨髓标本置于Percoll分离液梯度离心，吸取中间单个核细胞（MNC）白膜层，以1×106/ml的密度接种于培养瓶，培养体系为含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱培养。48h后换液，之后每隔3～4d换液1次，取出悬浮细胞后，BMSCs将不断纯化。当细胞生长融合达到80%～90%时，用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散的细胞。此时将细胞标记为P1代，以后每隔3～4d换液1次，当细胞生长融合达到80%～90%的时候，继续以1∶3的密度传代扩增培养，取第3代BMSCs细胞制成单细胞悬液，将细胞浓度调整为1×106/ml备用。1.4白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠模型制备及治疗参照预实验结果，分别对45例实验大鼠给予白毒伞粗毒素0.5mg/kg剂量灌胃1次，48h后即可制备稳定的白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠动物模型。造模成功后通过腹腔注射和经尾静脉注射对两治疗组大鼠实施BMSCs的输注治疗，共3次，1次/d，细胞数量1×106/（kg?次）。1.5观察指标①SD大鼠的生存情况、体重...