荧光原位杂交在非肌层浸润行膀胱尿路上皮癌术后随访中的应用1.江苏省苏北人民医院泌尿外科扬州225001*陕西省铜川市耀州区人民医院急诊科铜川727000;2.江苏省苏北人民医院妇产科扬州225001【摘要】目的:研究多色荧光原位杂交探针（FISH）在非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌术后监测的应用价值，并与尿细胞学检查相比较。方法:应用FISH和尿细胞学检查分析215例非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌术后随访尿沉渣标本。FISH探针是用随机引物法标记3、7、17号染色体着丝粒及9p21区带。比较分析两种检查结果。结果:215例中有58例患者病理证实膀胱尿路上皮癌复发。FISH对膀胱尿路上皮癌诊断高于尿脱落细胞学检查（71.4%和26.2%），并有统计学差异（P<0.05）；特异性分别为90%和95%，无统计学差异；阳性预测值分别是95.5%和95.7%，阴性预测值分别为52.9%和34.5%。结论:FISH检查可以作为非肌层浸润性尿路上皮癌术后随访的手段，并且敏感性高于尿细胞学检查。【关键词】膀胱肿瘤；尿路上皮癌；多色荧光原位杂交；尿细胞学检查【中图分类号】R746.2【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2010）09-0154-02四色探针(fluorescenceinsituhybridization,FISH)，在国外广泛用于尿路上皮癌的研究[1]，国内尚未见其应用于膀胱尿路上皮癌术后随访的报道。本研究将探讨其在膀胱尿路上皮癌术后随访中应用的可行性。1材料和方法1.1标本收集:2008.6~2010.1我院泌尿外科门诊及病房共有215例非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌常规随访患者，男144例，女71例，平均66.4岁（24~81岁），患者术后随访平均3.4年（3个月-10年），在膀胱镜检查或经尿道膀胱肿瘤电切术前留取晨尿，行FISH检查及尿细胞学检查。1.2FISH方法:按照美国Vysis公司UroVysion试剂盒说明书上操作[2]:(1)尿液准备：收集50-200ml晨尿，KCl（0.075mol/l）低渗、固定液（甲醇:冰醋酸3∶1）3遍固定、离心，制成尿沉渣固定液。(2)玻片准备：用2×SSC（pH7.0）洗涤、蛋白酶消化、1%甲醛溶液固定后梯度乙醇脱水，室温晾干。(3)尿沉渣制片：尿沉渣固定液滴片，56℃环境中老化滴片30min或室温下过夜老化。(4)原位杂交：在73±1℃的70%甲酰胺变性液变性5min后玻片标本依次置于预冷的梯度乙醇中各3min梯度脱水，经自然干燥，45~50℃预热2~5min后与变性后的探针混合液（7μl杂交缓冲液+1μl去离子水+2μl探针）于42℃杂交过夜。⑸杂交后洗涤、观察：玻片经50%甲酰胺、2×SSC（pH7.0）及0.1%NP-40洗涤DAPI染色后，荧光显微镜下观察计数。1.3FISH评估FISH结果评估:1.3.1阈值建立:20例健康人群每一个探针组合观察100个细胞。统计出现不同类型异常情况细胞数目的百分比。阈值=平均值（M）+3x标准差（SD），见表1。1.3.2判断方法:3、7和17中的两个染色体的扩增,p16纯合性缺失者判断为阳性，见图1。1.4尿脱落细胞学检查检查连续3天的尿标本，可疑结果计算为阴性。1.5统计学分析：应用卡方分析，统计软件为SPSS13.0软包。2结果共收集到215例浅表膀胱尿路上皮癌术后随访晨尿标本。FISH检查需要重复留取标本有17例，4例因为严重血尿，13例因为标本中细胞学过少。血尿严重者可以采取留取新鲜尿液并在FISH过程中适当稀释，尿沉渣中细胞数少可以收集多次留取晨尿沉渣以增加细胞数量，这样能满足FISH的需要。这两种尿标本对尿细胞学检查结果无影响。58例患者发现膀胱占位，术后病理证实为尿路上皮癌，复发率为26.9%（58/215）。FISH和尿脱落细胞学诊断膀胱尿路上皮癌的敏感性分别为72.4%（42/58）和37.9%（22/58），有统计学差异（P<0.05）；特异性分别是90%（18/20）和95%（19/20），见表1。FISH和尿细胞学检查与膀胱尿路上皮癌病理分级与临床分期之间关系见表2。注：检测值大于阈值，判定为阳性结果；如果检测值小于阈值，判定为阴性结果。如果等于阈值，加大观测样本细胞数目。图1(A)FISH-阳性细胞核;(B)3号探针红色荧光，7号探针绿色，均有非整倍性扩增；(C)17号探针绿色，为非整倍性扩增；9p21缺失3讨论保留膀胱的非肌层浸润性尿路上皮癌术后有很高的复发率，随访尤为重要[3]。尿中标记物如NMP22、Quanticyte及端粒酶等可以提高尿细胞学敏感度，但特异性较低[4]。尿细胞学虽然属无创...