肝硬化患者外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义

肝硬化患者外周血单核细胞中DcR3基因表达的意义杨光松原市长岭县人民医院(吉林K:岭131500))【摘要】目的探讨外周血单核细胞(PBMC)中DcR3基因表达水平与肝硬化的关系。方法64名肝硬化患者和60名健康对照者各取5ml静脉血,肝素抗凝,密度梯度离心法分离PBMC,TRIZOL法提取PBMC总RNA,用半定量RT-PCR法检测PBMC中DcR3基因的相对表达水平,并用t检验进行比较。结果肝硬化患者组PBMC中DcR3基因的相对表达水平为0.398&plusmn;0.034,与正常对照组(0.246&plusmn;0.023)相比有明显差异(P<0.05)。结论肝硬化患者PBMC中DcR3基因的表达水平增高。【关键词】DcR3基因表达肝硬化外周血单核细胞[中图分类号]R575.2[文献标识码]A[文章编号]1810-5734(2010)11-0087-02肝硬化的发病机制尚未完全阐明,但大量的资料表明肝硬化与自身免疫有关。而Fas/FasL系统介导的凋亡功能紊乱在某些自身免疫病的发病中起重要的作用[1]。新近发现一个可溶性受体蛋白诱惑受体3(decoyreceptor3)能竞争性地与FasL结合,从而阻断FasL诱导的凋亡,因此可能使Fas/FasL功能失调,在自身免疫病及肝硬化发病中起一定的作用[2]。木实验采用RT-PCR法检测DcR3基因在肝硬化患者及健康人外周血单核细胞(PBMC)中的表达,以探讨其表达与肝硬化的关系。1材料与方法1.1主要试剂及仪器:I•二烷基肌氨酸钠、DEPC购自Sigma公司,Oligod(T)、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、细胞分离液等购自Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。德国高速低温离心机HERMLEZ383,凝胶电泳成像分析系统TannonGISlOOO(Tannon有限公司,---本文来源于网络,仅供参考,勿照抄,如有侵权请联系删除---上海),深低温冰箱Formo(USA),恒温水浴箱DK28D(上海医用恒温设备厂),PCR仪FeroTec(杭州PCR仪有限公司)◊1.2研究对象:肝硬化患者64例,男38例,女26例,年龄35〜70岁,平均52岁。全部病人均经肝CT、及肝功能功能检査确诊,且未经治疗。健康对照组60例,男35例,女24例,年龄20〜65岁,平均46岁。1.3实验方法1.3.1PBMC分离:研究对象各取静脉血5ml,肝素抗凝;加入含5ml淋巴细胞分液的离心管中,离心2000r/min,20min,可见血浆与分离液的界面上有一白膜层,此即所需的PBMC。吸出细胞至另一试管用生理盐水洗3遍,离心2000r/min,5min,弃上清。1.3.2RNA的提取及RT-PCR:在上述PBMC标本中加入变性裂解液Trizol1ml吹打使细胞充分溶解,置室温5min后加入氯仿200&mu;l,剧烈震荡15s,室温5min,4°Cl2000rmin离心15min,取上清加入等体积的异丙醇,混匀后-20°Clh,4°C12000r/min离心lOmin,弃上清,加入75%乙醇lml,4°C7500r/min离心5min,吸去乙醇自然干燥10〜20min/溶于10&mu;IDEPC水中。此即人外周血总RNA。在上步得到的10&mu;l模板RNA中,加入l&mu;IDEPC水,l&mu;l引物Oligod(T),稍离心,10CTC沸水1min;加入2&mu;ldNTP,4&mu;l5&times;buffer,2&mu;IAMV逆转录酶,稍离心,42°0水浴90|1^11;沸水3min,灭活AMV,得到总cDNA。聚合酶链反应PCR扩增DcR3基因(214bp)和&beta;-actin基因(570bp)。引物序列:DcR3基因引物正义链为5&prime;-TCAATGGCCAGGCTCTTC-3&prime;,反义链为5&prime;-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3&prime;;&beta;-actin基因引物正义链为5&prime;-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3&prime;,反义链为5&p「ime;-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG-3&prirne;。1.3.3PCR产物的相对定量分析:5&mu;lPCR产物经1.5%的普通琼脂糖凝胶电泳后、漠化乙陡炎色、通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析,把DcR3/&beta;2actin的比值作为DcR3基因的相对表达水平进行比较。---本文来源于网络,仅供参考,勿照抄,如有侵权请联系删除---1.4统计学处理:数据以x&plusmn;s表示,采用t检验。2结果结果显示,健康对照组和肝硬化患者PBMC中均检测到DcR3基因的表达,PCR产物电泳后在214bp大小位置均见有一清亮条带,与预计的DcR3基因片段大小一致,同吋在570bp大小位置也显示有清亮条带,此为内参照基因&beta;-actin片段产物。DNA条带和强度分析示,正常人PBMC中DcR3基因有低水平的表达,其相对表达水平为0.246...

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