山东省鸡源大肠埃希菌I类整合子及基因盒研究魏秀丽+高迎春+陈玲+徐恩民+章安源+张琦摘要：研究了从山东省济南、德州等市肉鸡场分离的大肠埃希菌中Ⅰ类整合子及基因盒的流行状况。结果表明，整合酶基因检出率为53%；Ⅰ类整合子基因盒检出率为50%，大小为1085～2360bp，100株细菌中各含1～2个基因盒，其中dfrA17+aadA5检出率最高。Ⅰ类整合子在多重耐药大肠埃希菌中广泛流行，是细菌多重耐药性产生和扩散的重要机制，养殖场应科学用药，加强耐药性监测。关键词：整合子；基因盒；耐药性；大肠埃希菌；鸡源；山东：S858.31文献标识号：A：1001-4942（2014）09-0017-041989年Strokes和Hall首次提出整合子的概念。整合子存在于多种细菌中，是一种可移动的DNA元件，可捕获、剪切和整合外源性耐药基因并进行表达，且可以通过接合性质粒或转座子，使多重耐药基因在细菌中扩散。整合子/基因盒系统发现至今已经报道了60多种基因盒，以dfrA（甲氧苄氨嘧啶耐药相关）和aadA（氨基糖苷类耐药相关）基因家族为主，也在少数菌株中发现了aacA4、cmlA1、catB3、sat1以及blam-1基因盒编码氨基糖苷类、氯霉素、链丝菌素、β-内酰胺类等多种抗菌药物[1]。目前，国内外人源和动物源大肠埃希菌Ⅰ类整合子研究[1～12]虽然不少，但针对山东省肉鸡养殖场的大肠埃希菌的研究尚未见报道。本试验主要研究从济南、德州、济宁、淄博、聊城、烟台、青岛等市养鸡场分离的大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的分布，以探讨Ⅰ类整合子耐药基因盒在山东省有关市的养鸡场的流行情况。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1试验菌株200株鸡源大肠埃希菌，采自山东省各地市养鸡场，由本研究室鉴定保存。1.1.2试剂TaKaRaExTaq（5U/μL），内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、AccⅠ、FokⅠ，DNA分子量标准：DL2000（50ng/μL）、250bpDNAladder，均购自宝生物工程（大连）有限公司。1.1.3药敏纸片抗生素药敏纸片：磺胺甲基异恶唑/甲氧苄啶（SMZ/TMP）、庆大霉素、链霉素、壮观霉素、强力霉素、氨苄西林、氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素、阿莫西林，购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.4试验仪器PCR扩增仪（ABI公司）；电泳凝胶成像系统（BIO-RAD公司）；水浴振荡培养箱；数显多槽循环水浴锅；台式高速离心机，全自动高压灭菌器（日立）；超净工作台（苏州净化仪器设备有限公司）；冰箱（松下）。1.2试验方法1.2.1引物的设计及PCR扩增根据GenBank收录的Ⅰ类整合子序列，参考高迎春等[9]设计扩增Ⅰ类整合酶基因的引物intI-F、intI-R（预期扩增片段长度为280bp）以及扩增可变区（基因盒）的引物gcst-F、gcst-R（扩增片段长度不等），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。两对引物各自在合适的PCR反应条件下进行扩增。引物序列、DNA模板的制备、PCR反应体系、PCR循环条件、PCR产物的电泳分析方法见参考文献[9]。1.2.2基因盒PCR产物测序每种基因盒选取3株大肠埃希菌，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。基因盒测序结果经Blastn检索GenBank数据库（wwncbi.nlm.nih），获得同源信息，并分析其可能的功能。1.2.3药敏试验按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的K-B纸片扩散法检测。2结果与分析2.1Ⅰ类整合酶基因的检出情况Ⅰ类整合酶基因PCR扩增结果见图1。200株大肠埃希菌中有106株扩增到280bp的目的2.2基因盒的检出情况及分析鉴定挑选整合酶基因阳性菌株进行基因盒的扩增，结果见图2。Ⅰ类整合子基因盒检出了4种不同的目的片段，分别为1085、1740、1989bp和2360bp。在GenBank中用Blastn对测序结果进行比对分析，结果表明检出率较高的是链霉素、壮观霉素耐药基因aadA2、aadA5和甲氧苄啶耐药基因dfrA17、dfrA12。与吴聪明等[1～10]的检测结果相符，同时与药敏试验中菌株对壮观霉素、链霉素和SMZ/TMP的耐药结果一致。其中，有15株单独携带1989bp的片段，检出率为7.5%，依次排列有二氢叶酸还原酶基因dfrA12和氨基糖苷-3′-腺苷转移酶基因aadA2，介导细菌对甲氧苄啶和链霉素、壮观霉素的耐药性，在dfrA12和aadA2之间还有一阅读框orfF。15株单独携带2360bp的片段，检出率为7.5%，包括编码类似于志贺菌属中的氯霉素外排泵的基因proteincmlA1-variant...