齐墩果酸联合二甲亚砚对生物膜中粪肠球菌抑菌作用研究【摘要】目的：研究齐墩果酸联合二甲亚飒对单一生物膜中粪肠球菌的抑菌效果。方法：（1）采用微量棋盘液体稀释法测定齐墩果酸与二甲亚砚联合抑菌浓度分数指数（FICl）o（2）建立24h粪肠球菌生物膜模型，随机分为三组：1mg/mL齐墩果酸+50%二甲亚砚（A组）、2%氯己定（B组）、去离子水（C组）。各组药物分别作用30min后荧光染色，激光共聚焦显微镜（CLSM）观察染色情况及死、活菌数量变化。结果：（1）二甲亚砚和齐墩果酸对粪肠球菌的MIC分别20%和100Pg/mLo联合时FICI=0.5125o（2）A组、B组生物膜中以死菌为主，仅见散在零星分布活菌，C组生物膜中以活菌为主，仅存在极少量死菌。结论：齐墩果酸与二甲亚枫联合，对体外粪肠球菌的抗菌作用表现为相加作用，1mg/mL齐墩果酸联合50%二甲亚飒可有效抑制生物膜中粪肠球菌生长。【关键词】齐墩果酸；二甲亚砚；粪肠球菌;激光共聚焦显微镜[Abstract]Objective：Toevaluatetheantibacterialeffectofoleanolicacid(OA)anddimethylsulfoxide(DMSO)againstenterococcusfaecalis(E.faecalis)inbiofilminvitro.Method：(1)ThemicroscalecheckerboardtechniquewasappliedtocalculatetheFICIvalueofOAcombinatingwithDMSO.(2)E.faecalisbiofilmmodelswereformedafter24h・Sampleswererandomlydividedintothreegroups：1mg/mLOA+50%DMSO(groupA),2%chlorhexidine(groupB),deionizedwater(groupC)・Medicatingineachgroupsfor30minrespectively.Afterfluorescentstaining,sampleswereobservedbyCLSM.Result：(1)TheMICsofDMSOandOAagainstE.faecaliswere20%and100ug/mL.FICI=0.5125whentheywerecombined・(2)ThebiofilmsofgroupAandBweremainlycomposedofdeadbacteria,onlyscatteredlivingbacteriacouldbefound.ThebiofilmofgroupCwasmainlycomposedoflivingbacteria,onlytinydeadbacteriacouldbedetected.Conclusion：AdditivejointactionwasexistedbetweenOAandDMSOagainstE.faecalis.1mg/mLOAcombinatingwith50%DMSOcaneffectivelyremovethebacteriainbiofilms.【Keywords】Oleanolicacid；Dimethylsulfoxide；Enterococcusfaecalis；ConfocallaserseanningmicroscopeFirst-author'saddress：SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,Chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.003粪肠球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)具有超强的生存能力，在根管内形成生物膜后，粪肠球菌可明显增强抗力近1000倍，引起根管治疗后再感染,或导致难治性根尖周炎的迁移不愈［1-4］o粪肠球菌耐药性强，目前常用的根管消毒药物对于抑制根管内粪肠球菌生长的有效性、安全性尚不能达到较为理想的效果⑸。齐墩果酸(OleanolicAcid,0A)是五环三菇类化合物，普遍存在于多种天然植物中，毒性极低且具有良好的抑菌作用［6］。大量研究发现，0A能够抑制多种口腔病原菌的生长，其中包括粪肠球菌。二甲亚砚(Dimethylsulfoxide,DMSO)是研究0A常用的赋形剂，其对生物膜的渗透作用好，且其本身也具有抗菌作用［7-10］o但以往在研究0A抑菌性能时并未考虑DMSO抗菌作用对其可能存在的影响。本研究将0A溶于DMSO,采用微量棋盘稀释法、荧光染色激光共聚焦显微镜观察研究两种药物联合抑制浮游态粪肠球菌时的联合药敏效果，以弥补以往研究的不足之处；并研究其抑制单一生物膜中的粪肠球菌生长的有效性,探讨其用于粪肠球菌感染根管治疗的可能性。1材料与方法1.1材料粪肠球菌标准菌株ATC29212C四川大学华西口腔医学中心实验室）；齐墩果酸（0A）分析纯（绵阳东方源生物科技有限公司）；2%醋酸氯己定（Chlorhexidine,CHX）（上海麦克林生化科技有限公司）；二甲亚砚（DMSO）分析纯（北京索莱宝科技有限公司）；卩丫噪橙（Acridineorange,AO）（Sigma,美国）；漠化乙锭（Ethidiumbromide,EB）（Sigma,美国）；麦氏比浊仪（BiomerieuxSA,法国）；高压蒸汽灭菌消毒器（松下健康医疗器械株式会社，日本）；YQX-II厌氧培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；激光扫描共聚焦显微镜（Confocallaserscanningmicroscope,CLSM）（LeicaSP8,德国）...