2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。操作步骤：TM（苯冰预冷的900μlLS-Biotragents液体样品加入1.5mlEp管中，再加入1、将100μl酚和异硫氰酸胍的混合物）。2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。7、用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-FreeWater）将RNA溶解并于-20℃保存。注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1%DEPC水浸泡过夜。3、配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。（二）反转录实验安排：每人做一管。反应体系（20μl）：按下列顺序加样l4μ5×Bufferμl6dNTPsμl1RNA酶抑制剂μl1Oligo（dT）μ随机引μ反转录AMV1μ提取RNA6总体20μ1h42反应条件：℃注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR、引物，最后加酶和模板。dNTPsBuffer加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。℃，以防酶失活。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20PCR（三）实验安排：每人做一管。：按下列顺序加样μl）反应体系（50ddHO32.7lμ2510×PCRBufferμl4μldNTPs2P1μl2μlP20.3Taqμl4cDNAtemplateμll50Totalμ反应程序：预变性94℃2min30s变性94℃45s退火50℃1min延伸72℃30cycles10min℃72终延伸PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳TBE(10×)的配制：1、电泳缓冲液，定溶至1000ml。，并加入称取Tris-base54g，硼酸27.5g0.5MEDTA(pH8.0)20ml、1.5%琼脂糖凝胶的配制：2加100ml，×琼脂糖于三角瓶中，加入10ml10TBE缓冲液，并加水定容至称取1.5g，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子EB(10mg/ml)热溶解后加入5μl即可用于电泳。3、电泳检测：混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样μl产物5μl与LoadingBuffer1取PCR电流进行电泳，约100VDL2000DNAMarker作对照，以电压，50mA品孔旁加入5μl15min后于紫外灯下观察结果。注意事项：、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。1的试污染的手套随意拿其它无EB、禁止将盛有2EB的器皿随意乱放，且不要戴有EB剂或仪器。产物的纯化（四）PCR实验安排：Gel产物合并后作为一管，用PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A.每两人的PCRDNA。）回收目的ExtractionKit操作步骤：琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好、1PCR产物经1.5%管中。1.5mlEp重量的空管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。Ep、将装有胶粒的2．3、按1g胶加1ml的量加入BindingBuffer，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep管2－3次，使胶粒完全溶解。4、将上述溶胶液加入到HiBindspin-column中，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。5、加入300μlBindingBuffer，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。6、加入750μlSPWBuffer，静置2min，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。7、重复步骤6。8、空管10000×g离心1min，以弃去DNA回收柱中的残余液体。9、将DNA回收柱放入新的1.5mlEp管中，并加入30μlDNAElutionBuffer至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。注意事项：1、电泳时应换用新配制的TBEbuffer，否则会由于电泳缓冲液pH升高而降低DNA的产量。2、在切下含目...