食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1范围本标准规定了食品用双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定及计数方法。本标准适用于食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定；以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数，双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±1℃。2.2冰箱：2℃～5℃。2.3天平：感量0.1g。2.4无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm。2.5无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及配套吸头。2.6无菌培养皿：直径90mm。3培养基和试剂3.1双歧杆菌培养基：见附录A.1。3.2PYG培养基：见附录A.2。3.3甲醇：分析纯。3.4三氯甲烷：分析纯。3.5冰乙酸：分析纯。3.6乳酸：分析纯。3.7乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1mol/L。3.8乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定方法见附录B.1，此溶液浓度约为1mol/L。4检验程序双歧杆菌的检验程序见图1。图1双歧杆菌的检验程序5操作步骤5.1无菌要求：全部操作均应遵循无菌操作程序。5.2食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数半固体或液体菌种。真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉取1g菌粉状固体菌种溶于9mL稀释液10倍系列稀释选择2个～3个适当稀释度，各取1mL分别加入到无菌培养皿内，每个平皿加入15mL～20mL双歧杆菌琼脂培养基直接接种在双歧杆菌琼脂平板厌氧，48h36℃±1℃菌落计数固体菌种革兰氏染色，过氧化氢酶试验生化反应。乳酸和乙酸（可选项）菌种鉴定厌氧，48h36℃±1℃报告25g（mL）样品+225mL稀释液纯菌种食品样品5.2.1鉴定5.2.1.1接种：半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。真空冷冻干燥菌种，先加适量灭菌生理盐水，溶解菌粉，然后接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36℃±1℃厌氧培养48h±2h。5.2.1.2涂片镜检：双歧杆菌为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢、无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。5.2.1.3生化鉴定：挑取5.2.1.1步骤中的平板上生长的单个菌落，进行生化反应检测。双歧杆菌的过氧化氢酶试验为阴性。不同双歧杆菌菌种的主要生化反应见表1。5.2.1.4气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物（可选项），见附录B.1。5.2.2计数5.2.2.1样品的稀释5.2.2.2.1取1.0g固体菌种溶解于9.0mL生理盐水或其它稀释液，制成1:10的样品匀液。5.2.2.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有9.0mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。5.2.2.2.3另取1mL无菌吸管或吸头，按5.2.2.2.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。5.2.2.2.4根据对样品双歧杆菌浓度的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1.0mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1.0mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。5.2.2.2.5及时将15mL～20mL冷却至46℃的双歧杆菌琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。5.2.2.2培养待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃厌氧培养48h±2h。5.2.2.3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。5.2.2.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。5.2.2.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。...