第14卷第4期2005年8月激光生物学报AC7rAL蟠ERBIOLoGYSINICAv01.14No.4Aug.2005・激光生物与光子中医学・用光学二次谐波成像技术观察皮肤内不同种类的胶原j王毅1,鲍进1,盛巡2,李萍2,马辉¨(1.清华大学物理系,中国北京100084;2.北京中医医院药物研究所,中国北京100010摘要:目的:用光学二次谐波成像的方法比较成熟皮肤与新生皮肤内不同种类胶原的含量,以及正常皮肤与创伤皮肤内胶原种类的变化。方法:用前向及背向二次谐波观察正常及创伤皮肤内的胶原,并与传统的天狼猩红染色法相对照。结果:与传统方法相比,二次谐波可以更快速,更灵敏地检测组织中的胶原。背向二次谐波信号强度随着切片厚度的增加而增强。结论:光学二次谐波成像技术是一种灵敏、简单、快速检测皮肤组织内胶原的新方法,具有很好的应用前景,可应用于活体检测。关键词:二次谐波;光学成像;皮肤;胶原中图分类号:0437;口334文献标识码:A文章编号:10Cr7.7146(20Q5悼027年05Prob吨聊eI/ⅢCouag钮inDe肿is哪iIlgSecond1]【ar瑚IlicGen坨瑚ltionh衄雩堍删GK1,戤D胁1,船哪‰2,PⅡ垤2,心肌i1。(1.DeparhIlemofPhysics,Tsi咄mU证versitr,Beijing100084,Clli腿;2.Tra出donalC11ineseMedicineRes锄hI蒯tuteofBeij吨,Beijillg100010,伽mAbs仃ad:唰训Hann砌cGe响谢on(sHGim硒ngisusedto口k孵IandtypeⅢ洲【18聊iIl妇111is侧npariIlgwidl1l抡p0:Iarizati∞IIlicroscopriInagirIgofstainedcouagenbySiriIlsDed.7nleresI|:lts幽0wtllalopdcalSHGiIIl画IlgisIno陀鸵n-sidvetothe衄.e坞ntt,p瞄0fc0:盼geninde珊isandit咖beused鹊锄in、rivon0Ilinvasi、re乜00lt0evalu8cemeWrleradonofcoHa寥ni11wDmdk柚ir唔.Keywoms:Seo∞dI{a肋砌cGenel蜘on(跚G;opdcaliIIlagiIlg;出n;coagenⅡ二次谐波成像是新近发展起来的激光扫描非线性光学显微术。它利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源,具有高分辨、高对比度的三维成像能力。胶原、肌肉等生物组织能够产生很强的二次谐波信号【1剖。二次谐波可采用近红外光源激发,对生物样品的杀伤作用小,在高散射体中的穿透能力强,有利于提高探测深度。基金项目:北京市自然科学基金项目(项目编号:7043cr70收稿日期:2005-0每15二次谐波反映样品本身的非线性光学性质,可以不需要染料标记,避免由此带来的光毒性。该成像方法适合对活体进行动态测量,在生物医学研究领域具有广阔的应用前景。正常人皮肤中80%为工型胶原,其余大部分为Ⅲ型胶原,I型胶原排列有序,纵横交错,构成网状结构的真皮层;Ⅲ型胶原包裹着胶原纤维束,分布在第4期王毅等:用光学二次谐波成像技术观察皮肤内不同种类的胶原275边界结构处。在创伤恢复过程中,胶原的排列逐渐从无序到有序,Ⅲ型胶原在创伤愈合的开始占主导地位,在愈合的末期,Ⅲ型胶原又被工型胶原所代替。因此工型胶原与Ⅲ型胶原的比率是衡量创伤的愈后程度的重要指标。对于创口内,衡量I、Ⅲ型胶原比率的方法目前常采用组织特染和免疫组化两种方法。但特染仅能表达胶原总体的变化,不能同时区分I、Ⅲ型胶原的类型,且易褪色,不易长久保存和回顾性研究。免疫组化法,尽管特异性强,但操作程序繁琐,其染色效果受很多因素影响,如抗体效价,实验者经验等,结果不易稳定。且抗体较昂贵,不易保存,同时也不能在同一切片中反映两种胶原类型(I/Ⅲ型的变化。近来出现的天狼星红偏振光法H1虽然操作简单(同胍染色相近,但不能活体动态观察样品,是组化观察法的缺点。最近,特别是近一年,二次谐波成像在对活生物样品进行无损测量或者长时间动态观察方面显示出独特的应用潜力,得到方法学研究与生命科学研究领域的重视睁副,其图象质量高、杀伤小、不需要染色等特点也为长时间观察创伤愈合的动态过程提供了一种新的实验方法。在本试验研究中,我们将系统比较天狼星红偏振法与二次谐波成像法的成像质量的不同,及背向二次谐波强度与探测深度的关系,为二次谐波在动物活体上的应用奠定基础。1材料与方法1.1实验装置本工作在实验室已有的激光扫描双光子荧光显微镜基础上,通过改装信号探测外通道,从背向上收集信号,实现了背向二次谐波成像。背向二次谐波成像和双光子荧光成像都是从背向上进行探测,都...