卷柏活性部位对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响作者：付雪艳，董琳，马学琴，张义伟，武建军【摘要】目的探讨卷柏对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响。方法动物分为5组，每组8只，阳性对照组给予盐酸二甲双胍片，给药组分别给予卷柏水提液及大孔树脂50%乙醇洗脱组分(简称50%组分)，用RT-PCR方法检测大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达水平。结果阳性对照组、卷柏水提液、卷柏50%乙醇洗脱组分与模型组比较，大鼠肝脏胰岛素受体基因mRNA表达水平显著提高(P＜0.01)。结论卷柏通过改善大鼠肝脏胰岛素受体基因mRNA表达而改善胰岛素抵抗。【关键词】卷柏；肝脏胰岛素受体；mRNA卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring及垫状卷柏S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的全草。具有活血通经之功效，用于经闭痛经，症瘕痞块，跌扑损伤，本实验前期工作已经筛选了活性部位，证实其50%乙醇洗脱组分为活性部位［1］。本研究在此基础上，深入探讨了卷柏对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响，为其机制的进一步研究提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠，雄性，体重180～220g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证编号：SCXR(宁)2005-001，自由摄食和饮水，室温保持在(20±2)℃，湿度(50±1)%。适应性喂养1周。1.2试剂与材料卷柏购自毫州药材市场，经宁夏药检所鉴定为卷柏。盐酸二甲双胍片，批号20070915，规格0.5g/片，杭州中美华东制药有限公司；AB-8型大孔吸附树脂，购自南开大学化工厂；rTaq酶，美国Promega公司；MgCl2、10×bufer、PCRMarker、Trizol试剂，美国Invitrogen公司。Primer5.0软件设计，上游引物序列为5'-CCGGCGTGGCCTGCCCTCTGAT-3'，下游引物序列为5'-ATGATCACAGACTACCTGCT-3'，引物由上海博亚生物有限公司合成。β-actin(540bp)5'-GTCACCCACACTGTGCCCATC3'，5'ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3'。---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1.3样品制备卷柏2kg，粉碎，水煎煮3次，每次1h，滤过，合并提取液，浓缩得浓膏(1mg/mL)。所得浓膏经大孔树脂柱层析(树脂与生药质量比为1∶1)，分别用水、50%乙醇洗脱，得各洗脱部位，弃去水洗脱部分，将50%乙醇洗脱液浓缩，备用。1.4实验方法1.4.1模型制备及分组大鼠40只，体重180～220g，普通饲料适应性饲养1周，随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、卷柏水提液组、大孔树脂50%乙醇洗脱组分(简称50%组分)，每组动物8只。除正常对照组外，其余组大鼠1周后改喂高热量饲料制备动物模型(饲料组成：猪油15%，花生10%，蛋黄粉及糖、盐等，其余为基础饲料)10周［2］，自10周始，正常对照组和模型组灌胃(ig)给予等体积生理盐水，阳性对照组给予盐酸二甲双胍0.33g/(kg·d)，ig；治疗组分别给予卷柏水提液0.08g/(kg·d)，50%组分0.028g/(kg·d)，ig，共给药2周(以临床剂量为依据，由人鼠换算公式及提取分离转化率换算而得)。末次给药2h后，将大鼠处死，取肝组织，迅速置-70℃冰箱冻存，备用。1.4.2总RNA提取取冻存的肝组织约0.1g，采用Trizol试剂提取组织的总RNA，操作按说明进行。计算所提RNA量，使A260/A280比值保持在1.8以上。1.4.3cDNA的合成取上述标本RNA2μg，加入总量20μL下述混合液体。20μL反应体系：5×bufer4.0μL；10mmol/LdNTP2.0μL；逆转录酶0.5μL；上、下游引物各0.5μL，25mmol/L；MgCl21.5μL；RNA2.0μg；加入去核糖核酸酶(Rnase)的蒸馏水至20μL。37℃反应1h，95℃5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置于-20℃备用。1.4.4RT-PCR检测肝脏胰岛素受体mRNAPCR扩增管中加总量25μL下述混合液。20μL反应体系：模板cDNA1.0μL；5×缓冲液5.0μL；10mmol/LdNTP2.0μL；rTaq酶1.0μL；上、下游引物各0.5μL；加入双蒸水至20μL。反应条件：94℃，30s；55℃，60s；68℃，60s，30个循环后，72℃延伸5min。1.4.5RT-PCR产物分析取10μLPCR产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并记录拍照。采用Kodak2.0软件对PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。1.5统计学方法用SPSS12.0统计软件，结果以(±s)表示...