PPO测定参考上海市植物生理学会所编著方法[54]。5g果肉加10mlpH6.8磷酸缓冲液、少量PVP和石英砂，冰浴中快速研磨成匀浆，12000rpm，4℃，离心5min，上清液为PPO粗酶液。酶促反应体系包括0.5ml粗酶液、3.5ml磷酸缓冲液、1ml0.1mol·L-1邻苯二酚、以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.4漆酶活性测定漆酶测定参考杨建明等方法[55]。取5g果肉加10mlpH5.0醋酸缓冲液，冰浴中快速研磨成匀浆，12000rpm，4℃，离心5min，上清液为漆酶粗酶液。0.2ml粗酶液加入1.8ml醋酸缓冲液、1ml50μmol·L-1ABTS(λ420处消光系数：3.6×104M-1cm)，以缓冲液代替粗酶液在相同条件下测定为对照，测定3min内420nm波长处吸光值变化，以1min氧化1μmol·L-1ABTS的酶量最为一个酶活力单位。3.4.5PPO最适pH以PPO活性高峰期的砀山酥梨果实为材料，提取粗酶液。在不同pH值（pH3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.8、7.0、7.6、8）磷酸缓冲液各3.5ml中加入1ml0.1mol·L-1邻苯二酚，0.5ml粗酶液，以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.6PPO最适温度以PPO活性高峰期的砀山酥梨果实为材料，提取粗酶液。取3.5mlpH6.8磷酸缓冲液加入0.1mol/L邻苯二酚，分别于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃水浴20min，然后分别加入0.5ml粗酶液，以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.7PPO最适底物浓度以PPO活性高峰期的砀山酥梨果实为材料，提取粗酶液。将0.5mL酶液、3.5mL磷酸缓冲液中，分别加入1mL浓度为0.02mol·L-1、0.04mol·L-1、0,06mol·L-1、0.07mol·L-1、0.08mol·L-1、0.1mol·L-1、0.12mol·L-1、0.14mol·L----本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1、0.16mol·L-1、0.18mol·L-1、0.2mol·L-1的邻苯二酚，以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.8化合物对PPO活性影响磷酸缓冲液配制不同浓度（0.02mol·L-1、0.06mol·L-1、0.1mol·L-1、0.2mol·L-1、0.5mol·L-1、1.0mol·L-1）的EDTA、抗坏血酸、柠檬酸、山梨醇、蔗糖试剂，3.5ml上述试剂中加入0.5ml粗酶液、1ml0.1mol·L-1邻苯二酚、以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.9改良CTAB法提取RNA总RNA提取参照樊洪泓方法[56]。(1)取适量梨果实组织，加入适量的PVP，加液氮充分研磨至粉末状，转移至2ml离心管中，加入20-30μlβ-巯基乙醇和1ml65℃预热的提取缓冲液，剧烈震荡混匀，65℃温浴15min；(2)于4℃12000rpm离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中；(3)加入等体积酚（pH4.5）：氯仿：异戊醇（25:24:1），剧烈震荡，于4℃12000rpm离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中；(4)加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）剧烈震荡，于4℃12000rpm离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中（重复此步骤，直至界面干净）；(5)加入1/3体积的10mol·L-1LiCl，-20℃过夜，于4℃12000rpm离心10min；(6)用75％乙醇洗沉淀2次，沉淀于室温风干，加入50μLDEPC水，充分溶解后，于-70℃保存备用。3.4.10引物的设计利用DNAStar软件，对GenBank上已登录的PPO基因，如苹果、杏、水稻等氨基酸序列进行多重比对，比较氨基酸序列的同源性，在其中挑选间隔长度适宜、含有至少8个连续相同氨基酸的两段高度保守序列，分别为VHCAYCD和DPVFYAH，设计一对兼并引物：PPO正和PPO反序列为表1所示。并利用兼并引物克隆得到的保守片段设计3’RACE反应和5’RACE反应所需的巢式引物：...