毛白杨磷脂酶PtoPLC4的原核表达、纯化及鉴定张杰伟，张中保，陈亚娟，魏建华(北京市农林科学院，北京农业生物技术研究中心，北京100097)摘要：磷酸肌醇特界性磷脂陋C(Phosphoinositide-specificphospholipaseC,P1-PLC)是一类重要的磷酸肌醇信号途径中的酚。将已克隆的磷酸肌醇特并性磷脂酚C基因(PIOPLC4,GeneBankNo.JX861370)的编码区插入到原核表达载体pET28a上，经酶切和测序鉴定，成功获得了读码框止确的磷脂陋C原核表达载体(pET28-PtoPLC4):再将表达载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导后发现该重组蛋门主要以包涵体的形式存在。采川亲和纯化从町溶性蛋口中纯化到人小为64KD的蛋口条带。Western-Blotting分析亲和纯化所得蛋白可以与His单克隆抗体发生免疫交义反应，表明纯化所得蛋门是PtoPLC4重组蛋白。该结果为进一步研究PtoPLC4的生物学功能奠定了基础。关键词：毛白杨；PtoPLC4；原核表达；蛋白纯化：S722Expression,PurificationandIdentificationofPopulustomentosaphospholipasePtoPLC4inprokaryoteZHANG激ewei,ZHANGZhongbao,CHENYajuan,WEI激anhua(Bei激ngAgro-BiotechnologyResearchCenter,Bei激ngAcademyofAgricultureandForestrySciences,Bei激ng100097)Abstract:Phosphoinositide-specificphospholipaseC(PI-PLC)isacriticalenzymeinthephospholipidsignalingpathway.ThefulllengthPtoPLC4gene(GeneBankNoJX861370)wasclonedfromPopulustomentosaCaiT.cv"BIHROTsccdlingscDNA,andthenwasconstructedintopET28avectorcontaininghistidine・RecombinantpET28-PtoPLC4plasmidwasobtainedafterdigestionandsequence・TherecombinantfiisionproteinwasproducedaftertransformationintoE.coliBL21(DE3)withsubsequentIPTGinduction,anditexistpredominantlyinpelletofcellularextracts.ThefusionproteinwaspurifiedfromthesolublefractionusingacolumnofNi2+ChelatingSepharoseFastFlow,andproofedmolecularmasswas64KD.Theanti-HismonoclonalantibodyrecognizedtheproteinindicatedthatitwasPtoPLC4recombinantprotein.TheseresultswillassistinthestmcturalandfunctionalcharacterizationofPtoPLC4.Keywords:Populustomentosa;PtoPLC4;prokaryoticexpression;proteinpurification0引言磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,ptdlns)是真核生物中--种重要要的磷脂，Ptdins的磷酸化衍牛物统称为磷酸肌醇(PIs)o虽然Pls在真核细胞小仅占磷脂总量的2〜12%,但它不仅是构成细胞膜的基木组分，而冃它木身以及它的裂解产物是细胞与环境进行交流的重要信号分子⑴。现有证据表明动物细胞中Pls及其衍生物在信号转导起重要作用，这些信号转导途径受到诸如牛长因子、激素、神经递质及光等因素的诱导［2］。H前植物中的PI信号转导途径的相关研究主耍集中在其中主耍的磷脂酶C(PLC)通路上关键酶基因的克隆及其卞理功能的分析。基金项目:北京市科技计划(Z111100066111005)；“十二五”863计划(2011AA100201)作者简介：张杰伟，(1982J,男，助理研究员，主要研究方向：园林分子生物学。通信联系人：魏建华,(1971-),男，研究员，主要研究方向：园林分子生物学。E-mail:wei激anhua@baafs.E-mail:wei激anhua@baafs磷酸肌醇特异性磷脂酶C(Phosphoinositidc-spccificphospholipaseC,PI-PLC)是磷酸肌醇信号途径中一类重要的磷脂酶。4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinosito-4,5・bisphosphatc,PIP2)在PI-PLC的水解作用下生成IPs和DAG,IP3ft接进入胞质促进细胞内钙库中Ca2(的内流，DAG在植物体内进一步代谢形成磷脂酸(Phosphatidicacid,PA),进而参与和调节许多细胞的生理过程［3.4］。现何的研究表明：PI-PLCs不仅参与了植物的生长、发育，而且响应牛物胁迫和高盐、干旱、冷等非牛物胁迫［5J0］。在前期研究中，笔者从毛白杨中克隆了1个PI-PLC基因的全长eDNA,命名为PtoPLC4,序列已提交GenBank(JX861370);该基因在毛白杨不同组织中表达丰度不同,在叶片的表达量最高，其次为茎和根。胁迫处理的实验表明，PtoPLC4的转录主要受到NaCl和干旱的影响。本试验旨在通过将己克隆的毛白杨PtoPLC4基因，...