第19卷第5期2007年5月化学研究与应用ChemicalResearchandApplicationV01.19.No.5May,2007文章编号:1004.1656(200705-0562-04紫外分光光度法下直接测定蛋白质溶液的浓度焦利敏,廖学品,石碧+(1tJllⅡ大学皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都610065关键词:分光光度法;蛋白质;测定;A:30法;Lowry法中图分类号:0657.32文献标识码:ALowry法是目前蛋白质测定的常用方法¨o。它一般以牛血清蛋白作为标准蛋白来检测其它纯蛋白和混合蛋白质溶液的浓度。但是Lowry.法检测过程复杂、检测时间长、检测过程中蛋白质发生不可逆变性,而且硫酸铵、鸟嘌呤、甘氨酸以及其它生物物质旧1对检测结果有明显的影响。紫外分光光度法是一种直接测定方法,这种方法简单、灵敏、快速、检测过程中不使用任何显色试剂、蛋白质不变性,部分解决了Lowry‘法的缺点口4j。与280nln相比较,用205Dm处的吸光值来检测蛋白质溶液的深度灵敏度更高。但是用205nm处的吸光值来检测蛋白质浓度时杂质的干扰很大。考虑到紫外分光光度法狈0定蛋白质浓度时,最主要的干扰物质是核酸,而核酸在230nm附近有最小吸收∽'5J,本文拟选用230nlTl作为检测蛋白质溶液浓度的波长(以下称为A:∞法,为蛋白质含量检测建立一种快速简单的新方法。1实验部分1。1仪器及试剂紫外一可见分光光度计(UV-2501PC,日本岛津公司。牛血清蛋白(Bovineserllmalbumin,胃粘蛋白(Mucinfrompromporcinestomach,Typem,蛋清粉,生化试剂,购于Sigma公司;麦醇溶蛋白(Gliadinfromwheat,M-50000,生化试剂,购于Huka公司;牛血红蛋白(Bovinehemoglobin,M~68000,溶菌酶(Lyso.zynle,M~14400,生化试剂,购于上海伯奥生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯。1.2实验方法1。2.1纯蛋白质的工作曲线A:。。法标准曲线:用双蒸水分别溶解配制浓度为25、50、75、125、150、175、200、250I.zg・mL“的牛血清蛋白、麦醇溶蛋白、牛血红蛋白、胃粘蛋白、溶菌酶溶液。在230nrfl处测定各种蛋白质溶液不同浓度下的吸光值A。建立蛋白质浓度与吸光度关系曲线。对于牛血红蛋白溶液(50—250I.zg・mL“,进行A:,。法和Lowry∞法o两种测定方法的比较。同时,研究无机盐对A:加法测定结果的影响。1.2.2两种蛋白质混合溶液中蛋白质总量测定(1选择牛血红蛋白和胃粘蛋白,它们的吸光系数分别大于和小于牛血清蛋白的吸光系数。分别配制浓度为50一250I-Lg・mL。的牛血红蛋白溶液和胃粘蛋白溶液,然后将相同浓度的牛血红蛋白和胃粘蛋白溶液分别以1:1、1:2、2:1的质量比进行混合。以牛血清蛋白为标准蛋白,用A瑚法对混合蛋白质溶液进行检测,考察蛋白质浓度C与A的线性范围,并考察A:∞法检测到的蛋白质浓度与实际值之间的差异。(2吸光系数8均大于牛血清蛋白吸光系数8眦的两种蛋白质,选择牛血红蛋白和溶菌酶。分别配制浓度为100~250Ixg・mL。1的牛血红蛋白和溶菌酶溶液,然后将相同浓度的牛血红蛋白和溶菌酶溶液以1:1的质量比进行混合。以牛血清蛋白为标准蛋白,用A:,。法和Lowry法分别测定混合蛋白质溶液的浓度。1.2.3多种蛋白质混合溶液中蛋白质总量测定收稿日期:2006.12-01;修回日期:2007-02-08基金项目:"973”重大基础就翱珊究专项(加Ⅻ3cA舾1∞资助;国家自然科学基金项目(∞{7eD匣项目资助;国家自然科学基金I联|c:顷目(艇060∞资助联系人简介:石碧(1958一,男,长江学者特聘教授(博导,主要研究方向:植物单宁化学,制革化学。Email:sibitannin@vip.163.con第5期焦利敏等:紫外分光光度法下直接测定蛋白质溶液的浓度563选用蛋清粉作为混合蛋白试样,蛋清粉主要由蛋清蛋白和少量的溶菌酶以及其他蛋白质组成。配制浓度为100—200¨g・mL。1的蛋清粉溶液,以牛血清蛋白为标准蛋白,用A:,。法及Lowry法分别测定蛋白质溶液的浓度。加样回收率的测定:于50mL已知蛋白质浓度的蛋清粉溶液(100斗g・mL。中分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg的牛血清蛋白。以牛血清蛋白为标准蛋白,用A:∞法及Lowry法测定加样回收率。2结果与讨论皇日木—jpY}匕2.1纯蛋白质溶液2.1.1工作曲线按1.2.1方法操作和测定,结果表明:在25—250Ixg・mL卅的浓度范畴内,5种不同种类的蛋白质(牛血清蛋白、麦醇溶蛋白、牛血红蛋白、胃粘蛋白、溶菌酶溶液浓度C与其230n...