三种鸭防御素真核表达载体构建及其表达探析摘要：为研究鸭防御素的真核表达，人工合成了鸭防御素AvBD2.AvBDIO和AvBD12基因，并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒；重组表达质粒经酶切鉴定正确后，分别转染HEK293细胞进行表达，用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明，酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中；真核表达质粒转染HEK293细胞24h后，在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达；RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带关键词：鸭防御素；真核表达；HEK293细胞：Q78文献标识码：A：0439-8114(2016)24-6597-04D0I：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.24.068由于抗生素易导致药物残留、病原耐药性等问题，人们希望研发出安全有效的抗菌肽类药物，替代部分抗生素的使用。禽类防御素(Avianbetadefensin,AvBD)作为一类重要的内源性抗菌肽，具有广谱的抗菌活性和免疫调节功能[1],在禽类先天性免疫和获得性免疫中均发挥着重要作用。因此，禽类防御素极具新药开发价值，有望用于畜禽疾病的防控目前，人们已在家禽及某些野禽中发现了数十种禽类防御素，并且在大肠杆菌或酵母菌中成功表达了多种禽类防御素。然而，关于禽类防御素在动物细胞中表达的报道却很少。理论上，动物细胞能为表达蛋白提供更好地表达后加工和修饰，是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主［2］。如果能用动物细胞表达禽类防御素，将为禽类防御素的研究和应用提供帮助。本研究根据GenBank中已发布的鸭防御素基因序列，人工合成了3种鸭防御素AvBD2、AvBDIO和AvBD12基因，并构建其真核表达载体，在HEK293细胞中进行了表达研究,为鸭防御素在动物细胞中的表达提供了参考1材料与方法1.1细胞、菌株与质粒HEK293细胞及真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N由长沙赢润生物技术有限公司提供；大肠杆菌DH5?琢感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；表达猪B防御素1（PBD1）的重组质粒pDoub1eEx-EGFP-f1ag-N-PBD1由武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所构建1.2主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarker和蛋白质Marker等分子生物学试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；flag标签抗体购美国CMC公司；HRP标记羊抗小鼠IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；转染试剂Lipofectamin2000购自Invitrogen公司；PCR用试令1-鹤阅暇卜滴彳奚物❷科技有限公司；牛血清和细胞培养基为Gibco公司产品；其他常规试剂为分析纯1.3方法1.3.1鸭防御素基因的人工合成根据GenBank上公布的序列信息，人工合成鸭防御素AvBD2（登录号AY641439.1）、AvBDIO（登录号XM_005028240.1）和AvBD12（登录号KR018387.1）基因片段，并在基因片段两端引入BamHI和EcoRI酶切位点。基因合成后连接大肠杆菌克隆载体pUC57-Simple,测序验证合成的序列是否正确1.3.2重组表达质粒的构建根据设计的酶切位点将合成的基因片段进行双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段。同法回收酶切后的真核表达质粒，按如下反应体系和条件进行连接反应：10XT4DNALigaseBuffer1.0PL,T4DNALigase1.0uL,回收的pDoub1eEx-EGFP-f1ag-N质粒0.7uL,回收的AvBD基因片段7•3yL,总反应体积10.0uL,16°C恒温水浴中连接过夜1.3.3重组表达质粒的提取与酶切鉴定取大肠杆菌DH5?琢感受态细胞100uL,加入连接产物5UL并混匀,置冰上10min后，42°C水浴热激90s,随即冰浴2min；加入500uLLB培养基，恒温摇床振荡培养30min使其复苏；复苏后的菌液10000r/min离心2min,弃去500PL上清液，用剩余的100UL重悬菌体，涂布于含有25ug/mL卡那霉素的LB琼脂平板上；37°C倒置培养12〜16h,直至长出单菌落；挑取平板上长出的单菌落，接种到含卡那霉素的LB培养基中，恒温摇床振荡培养约8h。取培养后的菌液,用质粒小提试剂盒提取重组表达质粒，进行双酶切鉴定。酶切鉴定的反应体系：lOXKBuffer2.0uL,NheI1.0uL,EcoRI1.0uL,重组表达质粒12.0uL,加ddH20至20.0pLo37匸酶切4h后，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果1.3.4细胞培...