实验四：DNA片段的体外连接一．实验目的学会DNA的体外连接技术。用T4DNA连接酶将实验四中已回收的目的基因片段与相应的载体DNA片段（用相同的酶切，含匹配的粘性末端）连接起来，构建体外重组DNA分子。二．实验原理体外重组DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下、在含Mg2+、ATP等的连接缓冲液系统中，带有匹配末端的两个DNA片段连接而成的。DNA连接酶的作用步骤：①T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-TMP复合物（腺苷酰酶）。②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA片段上，使DNA腺苷化。③产生一个新的磷酸二酯键，并把缺口封起来。通过控制载体DNA与目的DNA的分子比例等来影响重组率。一般情况下，载体DNA的摩尔数与目的基因片段的摩尔数之比为1比5；目的基因片段的比例太大，容易产生基因自连后插入载体的多聚体。连接体积太大自连机会也会增多。连接反应的条件：1、缓冲液：一般都配成5~10倍的缓冲液。缓冲液中含有Mg2+、ATP作为辅助因子以为连接反应提供能量，同时也含有一些保护和稳定连接酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）可以防止酶氧化失活，BSA（小牛血清白蛋白）可使连接反应中维持有一定浓度的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低而使酶变性失活。2、温度：在37℃时有利于连接酶活性的发挥，但在这一温度下结合的粘性末端氢键是不稳定的，而且连接酶的活力也不能保持太久。因此，在实际操作时，折中采用催化反应与末端粘合相一致的温度，即12-16℃左右为宜，也可较温度如4℃下连接，但连接时间要延长。三．实验材料1.离心机、移液器2.回收纯化的DNA样品（Rv1791基因）3.T4DNA连接酶及其附带的缓冲液四．实验步骤连接体系：回收DNA片段6ulpCR2.12ul10×连接buffer1ulT4DNA连接酶1ulTotal10ul注意）连接条件：16℃金属浴连接过夜五．实验结果本次实验学会了DNA的体外连接技术，为后续实验将重组DNA序列导入受体细胞中做好准备。掌握基本的操作技能。六.思考题DNA的连接方式有哪些?(1)粘性末端连接：用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，可产生完全相同的粘性末端，然后在DNA连接酶的催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。如果两种不同的限制性核酸内切酶切割后产生配伍末端也可以进行连接(2)平末端连接：某些限制性核酸内切酶切割DNA后产生平末端，也可在DNA连接酶的作用下进行连接，且不管末端序列如何。(3)同聚物加尾连接：载体和外源DNA可在末端转移酶的作用下加上同聚物序列如，多聚A和多聚T，制造出粘性末端，通过A和T之间的退火进行连接(4)人工结构连接：对平末端DNA或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连接到平末端，使其产生新的限制性核酸内切酶的位点，再经限制酶切割后产生新的粘性末端进行连接.