Vol.30高等学校化学学报No.32009年3月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES465~467[研究快报]一种用于细胞核成像的新型双光子荧光探针刘鑫1,刘恒1,贾鹏飞1,张波1,王军杰2,赵宁2,张元红2,于晓强2(1.兰州大学生命科学学院,兰州730000;2.山东大学晶体材料国家重点实验室,济南250100关键词双光子荧光探针;双光子荧光成像;核酸O657文献标识码A025120790(20090320465203收稿日期:2008212202.基金项目:国家自然科学基金(批准号:50673053,NSFC/RGC50218001,50173015和30771091资助.联系人简介:刘恒,男,博士,副教授,主要从事细胞生物学研究.E2mail:hengliu@lzu.edu于晓强,男,博士,教授,主要从事双光子材料研究.E2mail:yu新疆@sdu.edu与共焦显微镜相比,双光子荧光显微镜(TPM在生命科学研究中具有较大的优势[1].其表现在避免了生物样品的紫外光损伤、光漂白和焦平面外的荧光干扰等.检测光路中不采用小孔光栅,对成像多自发荧光和高散射样品也有独特的优势[2],因此被认为是生物成像领域革命性的发展[3].然而,双光子荧光显微镜的进一步应用却因缺乏具有优良双光子荧光探针而受到制约[4,5].单光子和双光子的吸收过程遵循不同的选择规则[6],因此传统探针的双光子荧光活性吸收截面(σ×Φ较小,量子产率偏低[7].大双光子荧光活性吸收截面的探针分子的缺乏制约了双光子荧光显微镜对激光共焦显微镜的竞争力.目前,双光子荧光探针的设计和合成已经引起广泛的关注[8].核酸是与生命活动和疾病密切相关的生命大分子,但针对核成像的双光子核酸荧光探针的研究却鲜有报道[9].一些利用双光子显微镜的研究仍使用小吸收截面的Hochest和DAPI等传统探针[10].本文报道了具有大双光子活性吸收截面的DNA探针BMVEC,同时首次利用双光子显微镜完成了与DAPI的复染实验,实验结果证实了BMVEC对细胞核的选择性标记能力.1实验部分1.1探针的合成首先,用N2乙基咔唑通过Vilsmeier反应合成中间体92乙基23,62二甲酰基咔唑,同时利用碘甲烷合成中间体42甲基2N2甲基碘盐.然后在哌啶的催化下以甲醇为溶剂用2个中间体合成最终产物3,62双(12甲基242乙烯基吡啶292乙基咔唑碘盐(BMVEC(Scheme1,经过核磁、质谱和元素分析证明其为目标产物.Scheme1SyntheticroutesofBMVEC1.2光谱性质的测定吸收光谱和荧光光谱用PerkinElmerLambda235和HITACHF24500测定;双光子荧光用SpectroPro300i记录,泵浦光源为CoherentMira9002D飞秒脉冲激光.1.3细胞培养及染色采用人宫颈癌Hela细胞,DMEM培养基培养.染色后用ZeissLSM(LaserSca2ningMicroscopy,德国510成像.2结果与讨论2.1探针与DNA相互作用的吸收光谱为了阐明探针和双链DNA的作用机理,进行了紫外光谱监控下DNA对探针的滴定实验(见图1.由图1可见,随着DNA的加入,探针的线性吸收光谱明显改Fig.1DNAconcentrationdependentabsorptionproperty1.UV2VisspectraoffreeBMVEC;2.UV2VisspectraofBMVECsaturatedwithDNA.变.箭头1和2所指的分别为自由状态下和所有探针分子完全结合时的吸收光谱.在自由状态下,吸收峰在444nm处的吸光度为011359,随着DNA的不断加入,吸收峰逐渐红移,也出现了明显的增色效应.当DNA的加入量达到饱和时,吸收峰和吸光度不再变化,峰位和吸光度分别为466nm和012127.说明探针分子和DNA之间存在着相互作用,一般认为这种相互作用体现为探针分子插入了DNA分子的沟渠中,这是DNA分子光开关的常见现象[11],实验中的探针分子先发生减色效应,随后发生增色效应,这在DNA探针的研究中尚未见报道.2.2溶剂和DNA对探针荧光量子效率的影响表1给出了探针的一系列光谱测试数据,其中,λ1和λ2是线性吸收和单光子荧光的峰位,A是吸光度,ε是摩尔消光系数,Φ是量子产率,σ和σ×Φ分别是双光子吸收截面和活性吸收截面.表1中的数据说明,探针分子存在明显的溶剂化效应.在水相中,BMVEC只有很低的荧光量子效率,在有机相中,探针的Φ值有很大增加,当探针分子完全结合到DNA中时,其量子效率达到3018%,与水相中相比增加了181倍.完全达到了DNA分子光开关的要求.可以认为这是由以下两个因素所致:(1当BM2VEC插入到DNA的沟渠中后,周围不再有猝灭荧光的水分子[12];(2结合作用使探针的分子内扭曲运动受阻,分子的刚性增加,提高了BMVEC辐射...