PCR方法JenniferWalker-Daniels(jlwdatmaildotiastatedotedu)IowaStateUniversity,UnitedStates译者王秀英(maryatlabomedotcom)美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司(SynatomResearch)DOIhttp://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.2.119日期更新:2014-11-05;原始版:2012-04-19引用实验材料和方法2012;2:119英文摘要AnupdatedreviewofPCRmethods,includingconventional,real-time,microfluidic,anddropdigitalPCR.简介历史聚合酶链反应（PCR）是一种很普及的技术，广泛应用于临床诊断和分子生物学研究。PCR是由DNA聚合酶在体外扩增特定的核酸（NA）序列。PCR技术的飞跃发生在1983年，当KaryMullis推广使用了伴随温度循环的热稳定聚合酶[1-3]。PCR的普遍应用在于其能把数量很少的靶核酸序列，扩增成大量的PCR产物，然后通过下游方法检测，例如通过琼脂糖凝胶电泳观察核酸（NA）产物。这是由于核酸（NA）序列的指数扩增，使得起始模板（靶核酸序列）扩增产生数百万的拷贝。基本PCR反应PCR反应扩增靶核酸序列是通过使用DNA聚合酶，引物和核苷酸。PCR反应的模板可能是任何靶核酸序列，核酸的来源可能是DNA，RNA或cDNA。引物是体外合成的核酸短序列。引物的设计是互补结合于特定靶核酸模板的反义链，引物的长度通常是15-40个碱基。引物最好是缺少二级结构并且不彼此互补，以防止引物二聚体的形成。多种DNA聚合酶都可用于PCR，但最广泛使用的是耐热的TaqDNA聚合酶。这种酶根据模板的核酸序列进行引物延伸（在引物末端添加dNTPs或核苷酸）。PCR反应通常是20-40个温度循环。核酸模板序列的变性是在95℃进行的。引物退火结合与靶序列是在温度冷却至37-60℃进行的。引物的核苷酸延伸是DNA聚合酶在60-72℃的范围内进行的。常规的循环条件是起初95℃持续5分钟，使得所有的核酸模板变性，接着是重复2-40个温度循环（95℃持续30秒，60℃持续30秒，72℃持续1分钟）。对于具体试验，在每个温度上持续的时间可以优化。例如，很短的靶序列的扩增相比于很长的靶序列，在每个温度上需要持续的时间就要短得多。每个温度循环获得的靶序列产物都是前一个循环的产物的2倍。这就导致了原始模板的指数扩增，通常获得的产物是原始靶核酸序列的数百万或数十亿的拷贝。基本PCR反应有三个时期。指数时期是每个温度循环扩增的核酸产物都是确切倍增。实时PCR检测就是在指数时期进行的。线性时期发生的反应减慢是由于试剂的消耗和产物的降解。最后时期是平台期，就是反应停止，不再生成扩增产物了。常规PCR反应就是在平台期通过凝胶电泳分析PCR反应产物。[放大]图1.PCR反应的时期：在PCR反应过程中，在指数时期发生的是产物的倍增，在线性时期发生的是略低于倍增的产物扩增，在平台期发生的是非常低的几乎停滞的产物扩增。PCR反应的下游检测PCR产物的下游检测有许多种方法。一种常用的观察方法是通过琼脂糖凝胶电泳。这包括通过电泳分离核酸片段，使用嵌入染料如溴化乙锭或SybrSafe染色核酸片段，随后使用紫外线光源和成像系统检测（图2）。[放大]图2.DNA的琼脂糖凝胶的照片：最左边的一行是DNA梯状条带，包含已知大小的核酸片段。凝胶上最下面的条带是长度为100个碱基对的核酸片段。右面的几行是长度为120个碱基对的PCR扩增产物。实时PCR使用专门的热循环仪检测每个反应孔的荧光信号。这个信号指示的是反应管或反应孔所含的双链核酸的量。这个信号表示为相对荧光单位，是热循环仪软件相对于温度循环周期数而绘制的（图3）。[放大]图3.实时PCR扩增曲线：画图关联荧光信号与温度周期数。这个信号是实时测量的，因此可以随着PCR的进行，实时监测反应的进展。应用PCR广泛应用于科研，临床和法医领域。在分子生物学研究中，PCR常用于基因工程，DNA测序，基因表达分析。在临床实验室中，PCR对感染性疾病的检测是至关重要的。在司法鉴定中，PCR的应用包括亲子鉴定和DNA指纹。这些应用都是利用了PCR极高的敏感性，即使是来自人的一根头发中靶核酸序列，PCR也能检测出来。表一列出了PCR的主要应用及其参考文献。应用参考文献食物中病原体的检测[4,5]感染性疾病的诊断[6]基因分型[7,8]人类遗传突变的检测[9,10]microRNA的表达谱[1...