金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测田聪，余以刚，肖性龙，吴晖(华南理工大学轻工与食品学院，广州510640)摘要：为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养(VBNC)状态的复苏问题，釆取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌，尝试四种复苏方法，并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明：8%无菌Twccn80可以使VBNC状态金黄色萄球菌48h后复苏，同时PMA-qPCR能够冇效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌，克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。关键词：金黄色簡萄球菌；活的非可培养状态；复苏；PMA：荧光定量PCR：TS207.4；Q7Resuscitationofviablebutnon-culturablestateStaphylococcusaureusandPMA-qPCRdetectionTIANCong,YUYigang,XIAOXinglong,WUHui(CollegeofLightIndustryandFoodScience,SouthChinaUniversityofTechnology,GuangZhou510640)Abstract:InordertostudytheResuscitationofviablebutnon-culturablestateStaphylococcusaureus,threefactors:temperature,saltconcentrationsandpHwerecompositetoinduceVBNCStaphylococcusaureus・Fourdifferentresuscitationswereattempted,qPCRandPMAincombinationwithqPCRwasestablishedtodetectStaphyloccocusaureus・ThedateshowsthattheVBNCsamplescouldresuscitatein48hafterdisposed8%Tween80・Atthesametime,PMA-qPCRwasaeffectivemethodfordetectionofVBNCStaphyloccocusaureus,andcouldovercometheshortcomingsofplatecounts・Keywords:Staphyloccocusaureus;viablebutnonculturablestate;resuscitation;PMA;qPCR0引言微生物在自然环境中以多种生理状态存在：可培养的活菌，活的非可培养状态，具有完整结构但无生物活性的死菌以及细胞膜损伤死菌。徐怀恕等⑴通过对霍乱弧菌和大肠杆菌存活规律的研究,发现细菌存在一种"活的非可培养状态"(viablebutnonculturablestate,VBNC)O当细菌处于不良环境条件下时，用常规方法培养不能生长繁殖，但仍然具有•一定的活性。处于VBNC状态的细菌,仍具有毒性，在适宜的条件下有可能复苏⑵。不同菌种甚至同一菌种的不同菌株Z间进入VBNC的特征和复苏存在差异。£1然环境中的各种I人愫，如温度、渗透压、营养成分、氧气指数甚至光照强度若发生改变都可以诱导细菌进入VBNC状态，通常这些变化均是向着不利于正常细胞存活的方向的⑶。在实验室条件卜，可以通过控制金黄色簡萄球^(Staphylococcusaureus)的培养条件诱导其进入VBNC状态。曹小红等⑷将金黄色簡萄球菌分别在低温和巫金属条件下成功诱导使其进入VBNC状态，并且利用过氧化氢酶和吐温20使VBNC：状态金黄色筍萄球菌在短时间内实现复苏。目前对于金黄色葡萄球菌的VBNC：状态研究较少，并冃缺乏快速有效的检测方法。基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目资助课题(31101279)：中央高校基本科研业务费(2011ZM0101)：高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题(20110172120034)。作者简介：IH聪，(198),女，在读硕士生，主要从事食源性致病菌活菌检测。通信联系人：肖性龙，(1977-),男，讲师，研究方向为食品安全与检测。fcxxl@scut.cdu国内对金黄色葡萄球菌的检测主要参照国家标准检测方法进行。虽然对样木中冇无活菌的存在提供确切而直接的证据，但检出时间较长，步骤较为繁琐,不适用于快速检测。而标准难以检出处于VBNC状态的细菌。而荧光染料作为前处理手段，结合qPCR（fluorescencequantitative,^光定量PCR）技术用于活菌检测已经取得大量的研究进展，并忖具有广阔的潜在应用空间。PMA（propidiummonoazide,叠氮滉化丙锭）是一种选择性核酸交联染料，可以透过死细胞而不能透过活细胞的细胞膜，进入细胞后，PMA与DNA共价结合，从而阻碍了死细胞中目标DNA的扩增，结合荧光定量PCR技术检测活菌数，可以有效检测出样木中的活菌含量。VBNC菌是一-种细胞膜没仃损伤的活菌，理论上用PMA-qPCR方法检测可行⑸。尝试在实验室环境下利用低温、低盐、低pH等不良生长条件，体外诱导金黃色簡萄球菌进入VBNC状态的基础上，对VBNC状态的金黄色葡萄球菌进行复苏实验，同时验证PMA-qPCR法对VBNC状态的金黄色葡萄球菌检测...