哺乳动物细胞中光调控RNAi技术的研究#王建华，王雪，杜增民，赵玉政，杨弋**（华东理工大学药学院，生物反应器工程国家重点实验室，上海200237）510摘要：RNAi技术可以高效地抑制内源基因的表达，它已被广泛用于哺乳动物细胞内基因功能的研究中。而条件性RNAi技术可以从时空上可逆地调控基因的表达，为参与细胞生长发育过程的基因的功能研究提供有力的工具。本文将光诱导基因表达调控系统与RNAi技术相结合，以萤火虫荧光素酶基因（Fluc）作为报告基因构建了一个诱导RNAi系统，以光为诱导剂，调控哺乳动物细胞中基因的表达水平，并分别从表达载体和转录因子的启动子方面对系统进行了优化。研究结果表明，在蓝光照射下，系统大量表达shRNAmir片段，能够有效地抑制目的基因的表达。我们将在今后的研究中对系统进一步地优化，使之具有更广的应用范围。关键词：光诱导基因表达系统；RNAi；shRNAmir；萤火虫荧光素酶中图分类号：Q7815Studyoflight-regulatedRNAitechnologyinmammaliancellsWangJianhua,WangXue,DuZengmin,ZhaoYuzheng,YangYi(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,SchoolofPharmacy,EastChinaUniversityof2025303540ScienceandTechnology,ShangHai200237)Abstract:RNAinterference(RNAi)canefficientlyinhibitgeneexpressionandhasbeenwidelyusedtostudygenefunctioninmammaliancells.ConditionalRNAiapproachcanreversiblycontrolgeneexpressioninaspatialtemporalmannerthatprovidesanextremelyusefultoolforstudyinggenefunctioninvolvedincellgrowth,survivalanddevelopment.Inthispaper,webuiltalight-inducibleRNAisystembycombininglight-switchablegeneexpressionsystemwithRNAitechnologywhichusedfireflyluciferasegeneasthereporterandbluelightastheinducer.Weregulatedtheexpressionleveloftargetgeneuponblue-lightexposureandoptimizedexpressionvectorsandpromotersofthetranscriptionfactor.Theseresultsshowedthatthislight-induciblesystemcouldefficientlyinhibitgeneexpressionbyexpressionofshRNAmirwhenblue-lightwaspresent.Itisnecessarytofurtheroptimizethesysteminfuturestudiesandmakeitwiderapplications.Keywords:light-inducedgeneexpressionsystem;RNAi;shRNAmir;Fluc0引言RNAi是一种快速分析基因功能的有用工具，能够降低内源基因的表达水平，并能在单细胞或动物身上呈现出这种基因功能缺失[1,2]。化学合成的siRNAs通过转染进入细胞，是常用的在细胞内产生RNAi的方法[3,4]。通过病毒或质粒载体持续性表达shRNAs，能够稳定有效地抑制目的基因的表达。但是，当研究的目的基因对细胞的存活、细胞周期调控和细胞生长非常重要时，shRNAs的持续性表达限制了它的应用[5]。诱导型RNAi系统克服了这一不足，只有诱导剂存在时才会抑制目的基因的表达。这种系统的另一优点是能通过诱导剂的浓度和作用时间控制基因的表达水平。目前常用的诱导型RNAi系统有四环素调控系统[6,7]和蜕皮激素调控系统[8,9]，已成功地在细胞或转基因鼠体内基金项目：国家自然科学基金(31225008,31170815,31071260)；上海市科委“创新行动计划”基础研究重点项目(NO12JC1402900)；上海市曙光人才计划(11SG31)；高等学校博士学科点专项科研基金(20100074110010)作者简介：王建华，（1987-），男，硕士，合成生物学。通信联系人：杨弋，（1973-），男，博士生导师，蛋白质化学与合成生物学。E-mail:yiyang@ecust.edu.cn-1-诱导基因沉默。然而，这两种系统都存在一些缺点：四环素系统在非诱导状态下有相对较高的表达泄漏[10-13]，且诱导shRNA表达的速度慢[14]；蜕皮激素诱导系统的载体在宿主细胞的4550整合位点会影响表达水平[9]；两种系统都是通过化学诱导剂进行诱导，不能从空间上进行调控，而且会对机体产生一定的毒性作用。这些限制因素阻碍了RNAi技术的进一步应用。为克服这些局限性，我们构建了光诱导shRNAmir表达系统，在RNA聚合酶II启动子控制下，利用光敏转录因子调控shRNAmir的表达。本研究中选择荧光素酶基因作为报告基因，在蓝光下光敏转录因子发生二聚化，...