东北蟾蜍血清蛋白质成分初步分析何士敏王鑫分类号：Q512＋.1、2文献标识码：B文章编号：1004-311X(2000)02-0043-03东北蟾酥为两栖纲动物，蟾酥耳后腺及皮肤毒腺所分泌的白色汁液加工制成的蟾蜍，具有强心利尿、解毒清热的作用，是著名的中药。《本草纲目》谓蟾蜍是"攻坚结、祛疗毒、治恶疮之要药"。解放军第四军医大学研制的"蟾蜍抗癌胶囊"经大量动物和药理实验后用于临床，对肺、胃、食道、淋巴等多种恶性肿瘤有明显抑制效果。抗癌总有效率达93%。我们对蟾蜍血液中血清蛋白质的成分进行了初步分析。1材料和方法1.1材料：取东北蟾蜍洗净，固定四肢及头部，然后剪开腹部，用6号针头，2ml注射器，进行心脏采血(每只蟾蜍可抽出1ml左右鲜血)，血抽出后，立即注入小离心管内，放置1h后进行离心(4000r/min，15min)，离心后，吸取上面的黄色血清备用。1.2方法：参照醋酸纤维薄膜电泳法〔1〕用DYⅢ型电泳进行电泳分离。电泳时间为2h，电流为1mA/条，电压为6-8V/条，缓冲液为pH8.6，离子强度0.06的巴比妥一巴比妥钠缓冲液，每槽1000ml。染色采用氨基黑10B染色液染色10min，然后用漂洗液漂洗3次，每次5min，即可在薄膜上出现清晰的谱带。选取谱带多而清晰的薄膜量取膜上各条带的泳动距离，然后将膜放在清水中进行照像。拍照完毕，对入选膜进行定量测定，即将薄膜上的各个蛋白区带剪下，分别放入9支试管中，同时在同一条膜上剪下大小相应的无蛋白区的薄膜放入第10号试管中做为空白调零。然后向各管都加入4ml0.4M的NaOH溶液浸泡12h，在721-Ⅰ型分光光度计620nm处比色，记录OD值。对于很细的区带，例如第6条带，可将分离效果一致的5个膜上的这条带同时剪下，浸泡到4ml0.4M的NaOH溶液中12h，然后比色，所得数值除以5。根据各蛋白区带的OD620计算其相对含量。各种蛋白的相对含量等于其OD60值占蟾蜍血清蛋白OD总值的百分比。泳动度的计算按公式计算〔2〕，式中d值是电泳图谱中各条带的泳动距离，V为80V，t为7200s。2结果和讨论2.1电泳图谱分析结果表明，东北蟾蜍的血清蛋白质经醋酸纤维薄膜电泳可分离出9条谱带，即含9种蛋白质，在清蛋白区有4种，在球蛋白区有5种，两区之间有明显的蛋白空白区。从正极端开始依次为Α1-清蛋白、Α2-清蛋白、Β1-清蛋白、Β2-清蛋白、Α-球蛋白、Β-球蛋白、Γ-球蛋白、Δ-球蛋白、Ε-球蛋白，见图1。图19种蛋白质在图谱中的相对位置图中9种蛋白质的分类及编号参照常规的人血清蛋白质电泳图中各蛋白质的名称〔3〕编号得来。各蛋白带的泳动度见表1。表1蟾蜍血清中各蛋白的泳动度清蛋白球蛋白Α1Α2Β1Β2ΑΒΓΔΕd值(cm)3.133.072.742.591.921.641.280.850.58泳动度3.83.733.333.152.331.991.561.030.7(cm2／V。s)×10－5注：文中各表的数据均为10个重复实验(10只蟾蜍，每只蟾蜍10个薄膜)的平均值2.2东北蟾蜍血清中各种蛋白质的相对含量和清球蛋白比例：经测定分析，从东北蟾蜍血清中分离出的9条蛋白谱带的光密度总和OD总＝0.339，4种清蛋白的光密度总和OD清＝0.179，5种球蛋白的光密度总和OD球＝0.16，清球蛋白比为1∶0.9。各种蛋白占血清总蛋白的百分比见表2。表2东北蟾蜍血清中各种蛋白质的相对含量清蛋白球蛋白Α1Α2Β1Β2ΑΒΓΔΕOD6200.0380.0370.0520.0520.0350.0070.0230.0460.049相对含量(%)11.210.915.315.310.32.16.813.614.5蛋白质结构的种属差异较大，不同种属的动物的血清通过电泳分离，显示的图谱各不相同。动物血清中含有多种蛋白质，不同种类的蛋白质，它们各自有其独特的一级结构和构象，因而在pH值相同的同一种缓冲溶液，同一电场中，它们的带电性质和带电量有所不同、等电点有所不同，因而通过电泳的方法可将血清中不同种类的蛋白质分离开。以上结果表明，东北蟾蜍的血清蛋白质经醋酸纤维薄膜电泳可分离出9种蛋白质，这9种蛋白质的等电点和分子量不同，在pH8.6的巴比妥——巴比妥钠缓冲液中，它们都带负荷，向正极泳动。其中第1、2、3、4条带集中在一起，第5、6、7、8、9条带集中在一起，分成了两个带区，两区之间有明显的蛋白空白区。前一个带区的4种蛋白质的等电点都较小，偏离缓冲液的pH值8.6较远，故带负电量较强，属于清蛋白。后一个带...