猴支气管上皮细胞的原代培养及鉴定Error!Cannotreadordisplayfile.【摘要】目的：建立猴支气管上皮细胞的原代培养方法，为进一步研究肺癌的发生机制奠定基础。方法：体视显微镜下分离猴支气管粘膜层，用IV胶原酶消化粘膜层并培养猴原代支气管上皮细胞，采用鼠抗人角蛋白单克隆抗体(CK14)鉴定支气管上皮细胞。结果：IV型胶原酶消化法成功培养猴原代支气管上皮细胞，使用鼠抗人角蛋白单克隆抗体成功鉴定所培养细胞为原代支气管上皮细胞。结论：该方法是进行猴支气管上皮细胞原代培养的可行且有效的方法。【中图分类号】R734.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）25-0023-03AmethodfortheprimarycultureandidentificationofprimarybronchialepithelialcellsfrommonkeyZhuJing,WuYouru.DepartmentofRespiratoryMedicine,CenterHospitalofMianyang,Mianyang621000,China【Abstract】ObjectiveToestablishafeasiblemethodtocultureprimarybronchialepithelialcellsfrommonkey,andthereforetoprovideexperimentdatafortheinvestigationofthepathogenesisofpulmonarytumor.MethodTheepitheliumcarefullydissectedawayfromtheunderlyingtissuethroughastereomicroscopewasdigestedbythetypeIVcollagenase.Thebronchialepithelialcellsaresubcultured,frozenandidentifiedbythecytokeratin14antibodyfromthemouse.ResultThebronchialepithelialcellsaresubcultured,frozenandidentifiedbythecytokeratin14antibodyfromthemouse.ConclusionBythewayofthedissectionanddigestionoftheepithelium.wesucceedinculturingthemonkeybronchialepithelialcells.肺癌绝大部分（80%～90%）来源于各级支气管上皮，正常支气管上皮细胞的分离和培养也就成了进行癌基因致肿瘤研究的关键。然而，大多数作纤维支气管镜检查人的支气管上皮细胞都存在一些急性或慢性病变，因此，从与人类同源性最好的猴体内分离和培养原代支气管上皮细胞是研究原癌基因致肺癌机理的良好模型。本实验经过反复摸索，成功建立了分离支气管粘膜层，使用IV型胶原酶消化法做支气管上皮细胞（HBEPiC，humanbronchialepithelialcell）原代培养的方法，为进一步研究非小细胞肺癌的发生奠定了实验基础。1.材料与方法1.1实验动物雄性猴子一只，体重5公斤(2500kg)，合格证号0000974。1.2材料和试剂DMEM培养基、0.25%胰酶/EDTA、胎牛血清(FBS)（美国Gibco公司）；支气管上皮细胞生长培养基(HBEPiCMEDIUM)（美国SicienceCell公司）；青霉素钠、硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）；鼠抗人角蛋白单克隆抗体CK14抗体（abcam公司）；鼠尾胶原（millipore公司）；1.3实验方法1.3.1支气管上皮细胞的分离（1）深度麻醉猴子后分离出主气管及2～3级支气管，将取下的支气管迅速转入10%双抗浓度的DMEM培养基中，冰上运输至实验室。（2）置于超净台后，PBS冲洗两次，将其剪成1cm2大小平放于加有培养基及双抗的培养皿中。（3）在体视显微镜下用尖镊轻轻分离气管粘膜层，将分离出的粘膜层剪碎后用2mg/ml的IV胶原酶37℃孵箱消化1h，粘膜层被消化成絮状后（约1.5h），用0.22?m滤网过滤以除去组织块，含上皮细胞的消化液过滤至15ml的离心管中，室温下离心1000r/min×5min，弃上清，用HBEPiC培养液再洗涤细胞2次以去除残余的IV型胶原酶。（4）用HBEPiC培养液配制成细胞悬液，锥虫蓝拒染法检测细胞活力。将细胞接种于预先用鼠尾胶原打底的6cm培养皿中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。1.3.2支气管上皮细胞的培养由于支气管上皮细胞贴壁性不强，将细胞接种于预先打底的培养皿后，第二天仍置于孵箱原位置中。第三天将培养皿从孵箱轻轻拿出来后在显微镜下观察上皮细胞贴壁和生长情况，并换液8ml，此后2～3日换液一次。1.3.3支气管上皮细胞的传代及冻存（1）支气管上皮细胞的传代：当细胞生长达到90%融合时传代。传代时，用吸管吸出培养液，PBS洗涤板孔2次,加入0.025%胰酶/EDTA37℃消化约3～5min，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后加入含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复吹打板底使细胞脱壁均匀悬浮，取细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清...