经静脉神经干细胞移植治疗难治性癲痫实验探究132100吉林省吉林市中心医院神经内科摘要目的：观察难治性癲痫模型静脉注射骨髓基质细胞后行为学及细胞形态学的改变，为难治性癫痫的临床治疗开辟新的途径，奠定理论基础。方法：将20只SD大鼠随机分模型组（A组）、移植组（B组），每组10只。在大脑立体定向仪上定位大鼠大脑海马CA3区，用微量进样器缓慢注入KAlul,制成难治性癫痫模型，然后B组经尾静脉注入Hoeschst33342标记的骨髓基质细胞lml。取A组、B组鼠脑做HE切片，观察细胞形态学变化。结果：模型组的病理改变表现为海马周围卫星灶形成，腔隙层、辐状层和锥体细胞层有神经元吞噬现象，神经元缺失，其中CA3区表现得最为明显，齿状回苔醉状纤维出芽进行性增加。移植组较模型组海马周围卫星灶变小，细胞间隙较移植前减小，细胞增多且排列较整齐。结论：骨髓基质细胞具有修复癫痫病灶的能力。关键词癫痫骨髓基质细胞诱导分化移植doi:10.3969/j.issn.1007_614x.2011.11.005难治性癫痫是指临床经过迁延，频繁的癲痫发作至少每个月4次以上，应用适当的第一线抗癫痫药物正规治疗，药物的血中浓度在有效范围内，无严重的药物不良反应，至少观察2年仍不能控制发作，影响日常生活，同时并无进行性中枢神经系统疾病或占位性病变者。目前常用的抗癫痫药物在神经系统、消化系统、心血管方面的不良反应影响了其临床应用。外科手术切除癫痫病灶的方法会对病人的远期生活质量产生很大的影响。80年代许多学者致力于从胚胎脑中分离出神经细胞移植入受损的脑内，使神经功能得到明显改善，这说明神经细胞移植是治疗神经疾病的有效手段【sup】[1，2]【/sup】。研究发现，骨髓中间质干细胞（MSCs）具有干细胞持续增殖和多向分化的特性，在一定的条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等【sup】[3]【/sup】，可自体移植，不存在免疫排斥反应，使其成为细胞移植治疗理想的选择。采用4〜6周龄，体重120〜160g的SD大鼠为研究对象，将以Hoeschst33342标记的BMSCs经尾静脉注入难治性癫痫的大鼠体内，了解细胞移植治疗对癫痫大鼠神经功能的改善情况，从而探讨BMSCs对癫痫的修复和治疗作用，现报告如下。资料与方法实验动物：细胞培养选择4〜6周齡Wister大鼠，动物模型选择6〜8周齡Wister大鼠。主要试剂：DMEM-LG培养基、胎牛血清、胰蛋白酶bFGF、EGF、Hoeschst33342、Percoll淋巴细胞分离液戊巴比妥、海人酸、肝素、注射用青霉素钠、注射用链霉素。主要仪器：细胞培养瓶、超净工作台、CO[sub]2L/sub]培养箱、倒置相差显微镜（Olympus）、离心机、电子天平、冰箱、烤箱、微量进样器、脑立体定向仪。试剂配制：①低糖DMEM培养基的配制：DMEM培养基10.0g,青霉素105IU,链霉素105IU,NaHCOtsub]3[/sub]3.7g,加入三蒸水800ml,用稀盐酸调制pH值7.2,定溶1000ml,0.22um微孔滤膜过滤。将配置的培养液进行负压抽滤除菌，分装备用。使用前加胎牛血清（终浓度10%）。②PBS液的配制：NaCl8g,KCI0.2g,Na【sub】2【/sub】HPO【sub】4【/sub】1.15g,KH【sub】2【/sub】P0【sub】4[/sub]0.2g,加三蒸水800ml，充分溶解后，调pH值7.2，定溶至1000ml。③胰蛋白酶的配制：称取0.25g胰蛋白酶，将其溶于100mlPBS液中，洁净工作台中抽滤分装备用。试验方法：①大鼠骨髓基质细胞体外分离、培养：取4〜6周龄Wister大鼠，1%戊巴比妥0.4ml/100g腹腔麻醉后拉颈处死，置于75%酒精中浸泡5〜10分钟，再用75%酒精、3%碘酒消毒大鼠双侧下肢，在无菌条件下取大鼠双侧股骨和腔骨，剔除骨表面附着的肌肉组织，用无菌注射器抽取DMEM培养液，不含胎牛血清。从骨的一端冲洗骨髓腔，反复冲洗数次，另一端收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用5号针头注射器反复抽吸以打散组织块成为均匀的细胞悬液，然后以1:1的比例缓慢叠加到密度1.073g/L的percoll淋巴细胞分离液上，以2000转/分离心15分钟；收集中间乳白色的单个核细胞层，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液调节细胞密度2X10【sup】5【/sup】/ml,然后将单个核细胞接种到25cm【sup】2【/sup】的塑料培养瓶中，置于37°C>5%C0【sub】2【/sub】饱和湿度的⑶【sub】2【/sub】培养箱中培养，24小...