黎韦睿大蒜中SOD的分离纯化3120100025应用生物科学一、实验意义SOD（超氧化物歧化酶）是广泛存在于生物体内的一种含金属酶，具有催化超氧自由基生成过氧化氢和氧气的反应的功效，在防御生物体免受超氧自由基损伤、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、及延缓机体衰老等方面都具有重要作用。但天然SOD稳定性较差，在体内的半衰期较短，因此难以在生活中应用。本实验旨在通过生活中常见的材料——大蒜，提取具有研究价值的化合物，以提高获取SOD的效率，促进对SOD的利用。二、实验原理一般认为SOD酶稳定性不强，但SOD酶比较耐热。因此分离纯化时可以利用SOD酶这一特点，采用热变性的方式使其他不耐热的蛋白变性沉淀，达到除杂的目标。而盐析是酶分离纯化经常用到的技术，该技术能有效将目标蛋白和其他杂质分开，而且能有效浓缩酶液。经实验可知，当硫酸铵浓度达到80%时SOD酶析出量较高，而在40%时杂质蛋白质析出较多。层析分离具有设备简单、操作方便等特点，在实验室和工业化生产中均广泛应用。大蒜是生活中常见的一种食材，具有产量高、价格低廉的特点。与此同时，大蒜内含有丰富的SOD酶，发芽的大蒜由于新陈代谢速率加快，SOD酶含量更高，因此从大蒜中提取SOD酶具有高效率、低成本的优点。三、实验材料材料：大蒜（发芽的最好），磷酸缓冲液，硫酸铵，微晶纤维素粉末，醋酸缓冲液四、实验步骤1.取一定量大蒜，洗净并吸干水后，称取5g，与20mlpH值为7.8、浓度0.05mol/L、内含0.001mol/L浓度EDTA的磷酸缓冲液混匀并捣碎、匀浆。2.将浆液超声破碎5min，4000r离心20min，取上清液。3.将上清液置于55、60、65、70、75、80℃水浴中分别加热20min，4000r离心20min4.测量上清液体积，将硫酸铵缓慢加入上清液，使其达到40%饱和后放入4℃冰箱冷藏1h5.8000r离心15min，弃去沉淀6.在上清液中加入硫酸铵粉末，使其达到80%饱和度，在4℃冰箱中冷藏2h7.在冷冻状态下8000r离心15min，弃去上清液8.在10mlpH7.8的10mmol/L磷酸缓冲液中溶解沉淀，具体体积可视情况进行添加或减少，并用同样缓冲液进行透析9.8000r离心10min，弃去沉淀，称量提取液体积10.称取15-20g微晶纤维素粉末，悬浮于200ml含1%Tween20的水溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌1-2h，静置片刻，弃去悬浮杂质，抽滤，用蒸馏水充分冲洗干净后悬浮于200ml醋酸缓冲液（0.01mol/l，pH4.0），于4℃环境中装柱（2*20cm），以醋酸缓冲液彻底平衡柱子。将透析液上样于平衡好的微晶纤维素柱，继续用4倍柱体积的醋酸缓冲液洗脱柱子，然后分别用含0.1mol/l和0.2mol/l的醋酸缓冲液阶段洗脱柱子，收集活性组分11.测量产物体积以及蛋白含量12.采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶比活力，以每毫升反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶活力单位四、预期结果希望本实验中能够获得浓度较高的SOD溶液，产物体积则取决于所加入液体的体积。另外，还希望能够通过进行操作较为繁琐的实验，提高对不同实验方法的熟练度以及物质提取、纯化的操作水平。参考文献：杨华,周小苗,方亚东等.大蒜SOD酶的分离纯化和肝素修饰[J].湖南农业科学,2011,(13):115-117.DOI:10.3969/j.issn.1006-060X.2011.13.034.