基因组学与应用生物学，2011年，第30卷，第5期，第556-563页GenomicsandAppliedBiology,2011,Vol.30,No.5,556-563研究报告ALetter大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变周兴1,2韦星明2杨祥开2郑元涛2庞浩3许黎明2黄日波1,3*1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2广西科学院生物研究所,南宁,530007;3生物质能源酶解技术国家重点实验室,广西科学院,南宁,530007*通讯作者,rbhuang@gxas.ac.cn摘要大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖，具有一个可能控制产物特异性的325RLDRD329基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变，共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N5个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析，结果显示所构建突变体的Km值上升约2~5倍，比活力下降至野生型SI比活力的11.8%~25.3%。HPLC分析显示Arg325和Arg328分别突变为Asp，导致产物中异麦芽酮糖/海藻酮糖的比例从6.93分别降至0.96和2.92，并伴随一个未知寡糖出现。Arg328突变为Ala和Gln同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升，异麦芽酮糖比例下降。但是突变体D329N反应产物比例没有变化。以上结果表明325RLDRD329基序对大黄欧文氏菌蔗糖异Site-directedMutationinaProduct-Specificity-ControllingMotifofSucroseIsomerasefromErwiniarhaponticiZhouXing1,2WeiXingming2YangXiangkai2ZhengYuantao2PangHao3XuLiming2HuangRibo1,3*1CollegeofLifeScienceandBiotechnology,GuangxiUniversity,Nanning,530005;2BiologyInstitute,GuangxiAcademyofSciences,Nanning,530007;3StateKeyLaboratoryforBiomass&EnzymeTechnology,GuangxiAcademyofSciences,Nanning,530007*Correspondingauthor,rbhuang@gxas.ac.cnDOI:10.3969/gab.030.000556AbstractSucroseisomerase(SI)fromErwiniarhaponticiisomerizessurcosetoproduceisomaltuloseandtre-halulose.Ithasamotif(325RLDRD329)whichmaycontroltheproductspecificity.Inthisstudy,thechargedaminoacidresiduesofthemotifhavebeensite-directedlymutated,and5mutants(R325D,R328A,R328D,R328QandD329N)wereobtained.Byanalyzingtheenzymaticcharacteristicsofthemutantsandtheproductcompositionofsucroseconversioncatalysedbythemutants,wefoundthattheKmofthesemutantsincreasedbyabout2~5foldsandthespecificactivitydecreasedto11.8%~25.3%thatofwild-typeenzyme.ThereplacementofresiduesArg325andArg328respectivelytoresidueAspresultedinadecreaseoftheisomaltulose/trehaluloseratiofrom6.93to0.96and2.92respectivelyinthereactionproductsandtheemergenceofanundeterminedoligosaccharidebyHPLCassay.MutationofresidueArg328withAlaandGlnrespectivelyalsoincreasedthepercentageoftrehaluloseandreducedthepercentageofisomaltuloseinthesucroseconvertedproduct.However,theratioofisomaltulose/trehalulosefor-mationbyD329Nmutantwassimilartothatofwild-typeenzyme.Basedonourresults,webelievethatthe325RL-DRD329motifisessentialfortheactivityofSIfromE.rhaponticiandalsoaffectstheproductspecificityofthisen-zyme.OurresultswillprovideafoundationforunderstandingthemechanismofSI.蔗糖异构酶(sucroseisomerase,SI,EC5.4.99.11)是分子内异构酶，可以通过分子内转糖苷作用转化基金项目：本研究由国家科技支撑项目(2007BAD75D06)和广西科技攻关项目(桂科攻0895003-4-1)共同资助蔗糖(sucrose,2-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructofuran-ase)形成异麦芽酮糖(isomaltulose,6-O-α-D-glucopy-ranosyl-D-fructofuranase)和海藻酮糖(trehalulose,1-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructofuranase)(图1)，并伴随产生少量的蔗糖水解产物—葡萄糖和果糖。酮糖合成酶(trehalulosesynthase)。如何从SI序列和蛋白结构上的差异解释不同微生物来源的SI产物中异麦芽酮糖和海藻酮糖比例的变化?Zhang等(2003b)通过对源自克雷伯氏菌LX3的异麦芽酮糖合成酶PaI的蛋白质二级结构分...