在体微透析检测豚鼠胆红素脑病模型脑组织兴奋性氨基酸神经递质

在体微透析检测豚鼠胆红素脑病模型脑组织兴奋性氨基酸神经递质作者:贲晓明陈舜年秦玉明何振娟孙安阳吴圣楣[摘要]目的探讨胆红素脑病动物模型制作及其脑组织中兴奋性氨基酸(EAA)神经递质变化。方法豚鼠腹腔内给予胆红素200μg/g后8h,电镜观察脑组织形态结构,在体脑内微透析提取神经突触间细胞外液,HPLC检测分析天冬氨酸(Asp),谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)。结果胆红素毒性脑组织神经元及其线粒体肿胀,细胞外Gly含量为21.35±4.87μM,明显高于对照组14.02±1.56μM(P<0.01);胆红素毒性脑组织细胞外Asp,Glu与对照组比较差异不显著(P>0.05)。结论胆红素毒性脑组织细胞外甘氨酸(Gly)含量增加,可提高NMDA受体对EAA神经递质Asp及Glu敏感性,致NMDA受体过度活化。[关键词]兴奋性氨基酸;胆红素脑病;脑内微透析;高效液相色谱;豚鼠[分类号]R-332[文献标识码]A[文章编号]1008-8830(2000)01-0018-03MicrodialysisofHippocampusforMeasurementoftheNeurotransmitterinBilirubinInducedEncephalopathyGuineaPigsinVivoBENXiao-Ming,CHENShun-Nian,QINYu-Ming,etal.(XinhuaHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200092)Abstract:ObjectiveTostudytheexcitatoryaminoacid(EAA)neurotransmitterconcentrationinbilirubininducedencephalopathy.MethodsGuineapigswithbilirubin-inducedencephalopathywerefixedinthestereotaxicframe.Themicrodialysisprobewasinsertedinthehippocampuszone,Kreb'sringerwasirrigatedandextracellularliquidwascollectedforanalyseswithhighperformanceliquidchromatography(HPLC).ResultsTheconcentrationofEAAneurotransmitterGlyintheextracellularliquidofthebilirubinprecipitatedbrainwas21.35±4.87μM,significantlyhigherthanthatinthecontrolgroup(14.02±1.56μM).EAAneurotransmitterGluandAspdidnotshowanysignificantchangeintheanimalmodelcomparedwiththecontrol.ConclusionsTheincreaseofEAAneurotransmitterGlyconcentrationintheextracellularliquidofthebilirubinprecipitatedbraintissuesmightincreasethesensitivityoftheligandAspandGlutotheNMDAReceptor.Keywords:Excitatoryaminoacid;Bilirubinencephalopathy;Microdialysis;Highperformanceliquidchromatography;Guineapig新生儿高胆红素血症是新生儿临床常见病症,并发胆红素脑病可致新生儿死亡,幸存者常留下神经系统后遗症,合理科学防治胆红素脑病对于优生优育有重要价值。近年来研究表明NMDA受体过度活化参与胆红素脑病发生[1],为进一步探讨NMDA受体活性变化的内在机制,我们对胆红素神经毒性新生豚鼠进行在体脑内微透析,提取神经突触间细胞外兴奋性氨基酸(excitatoryaminoacids,EAA),并作高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测分析。1材料与方法1.1动物模型制作生后1~2d豚鼠18只,重20~25g,雌雄不拘,购自上海生物制品研究所。随机分成对照组和模型组,每组9只。对照组豚鼠予生理盐水0.5ml腹腔注射,模型组豚鼠[2,3]于腹腔内给予胆红素200μg/g。1.2脑组织形态结构观察动物模型制作后8h,取豚鼠脑组织投于戊二醛溶液中,乙醇梯度脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,电镜观察。1.3微透析提取神经递质微透析探头(microdialysisprobe)购自瑞典CMA公司,透析膜长3mm、直径0.5mm、透析截流分子量20000Daltons,探头长14mm,不锈钢外管直径0.64mm。模型制作8h后用乙醚吸入麻醉,按Sander方法[4]将大鼠固定于立体定向仪(stereotaxicframe)中,参照鼠立体定向图谱,将探针固定于海马区域(探针位置术后经由解剖证实)。灌流液为Kreb's-ringer液,流速2.5μl/min,灌流1.5h后开始收集检测样本,持续收样1h。1.4EAA神经递质HPLC分析取微透析细胞外液50μl、加内标液(甲硫氨基砜250μM/L)50μl,涡流振摇,加入micropureseparator(millipore)离心去除蛋白质、核酸及悬浮大颗粒。取滤液50μl,加入衍生化试剂(PITC异硫氰酸苯脂∶甲醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)50μl涡流振摇、室温反应10min,真空干燥[4]。真空干燥样本加入NaH...

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